含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物及其制备方法和应用

昵称63892284 2019-06-21

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技术领域

[0001] 本发明涉及一种含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物，属于兽药领域。

背景技术

[0002] 传染性法氏囊病是由传染性法氏囊病病毒(Infectious BursalDiseaseVirus, IBDV)导致的一种高度接触性传染病。以法氏囊肿大、肝脏损伤为主要特征，能引起雏鸡的免疫抑制。该病呈世界性分布，我国也时有发生，造成了严重经济损失。

[0003] 鸡传染性法氏囊病活疫苗主要分为传染性法氏囊病囊体组织灭活疫苗和传染性法氏囊病毒细胞培养灭活疫苗；灭活疫苗目前在市场上存在有20多种，包括2512HEP、LZD228、Lukert、228E、D78 及 B2 等。

[0004] IBDV的VP2上至少包含3组抗原表位即中和性抗原表位、非中和性抗原表位及毒力相关性抗原表位，VP2具有血清型特异性位点，并能诱导产生抗病毒的血清中和抗体，是IBDV的主要保护性抗原基因。动物免疫试验表明，大肠杆菌表达的IBDV VP2免疫SPF鸡后在抵抗强毒攻击的同时，会伴随着很强的副作用，可能与疫苗中包括大量的大肠杆菌产内毒素有关。而酵母表达的IBDV VP2免疫SPF鸡后，能够产生特异性抗体，并在一定程度上抵抗超强毒的致死性攻击，但还不能保护法氏囊组织完全不受侵害和损伤，免疫效果尚不如常规灭活疫苗和大肠杆菌产的亚单位疫苗，这可能是与酵母表达的过程中VP2蛋白中的过度糖基化、免疫剂量和佐剂配比等因素有关。

[0005] 随着我国养鸡业的集约化发展，传染性法氏囊病已成为危害养鸡业的一种主要传染病，变异株和超强株的出现，使该病防制的难度加大，目前虽然研制了多种商品化的弱毒疫苗和灭活疫苗，但其安全性和制作工艺尚有不尽人意之处。如为抵抗超强毒的攻击，使用中强毒力的毒株研制活疫苗，给IBD的防制带来极大的隐患；灭活苗存在着抗原制备的困难。因此，亟需免疫原性好、安全性高的新型疫苗问世。用大肠杆菌、酵母、杆状病毒表达IBDV vp2等系统，普遍存在表达量低，副反应大，保护率不高等缺点。用大肠杆菌表达系统研究开发亚单位疫苗和活菌载体疫苗的研究也进行了多年，但已知的研究结果是，大肠杆菌表达IBDVVP2蛋白无免疫原性或形成不溶性包涵体无法用作疫苗。

[0006] Rong J 等人(Jun Rong, Taipin Cheng, Xiaona Liu, Taozhen Jiang, HongGu, Guolin Zou，预防雏鸡传染性法氏囊病的新型重组VP2疫苗，Vaccine 23(2005)4844 -4851)在大肠杆菌中表达出VP2蛋白，请参见图1，蛋白免疫印迹分析重组蛋白，蛋白条带用辣根过氧化物酶标签显色，泳道I和2分别为E.coli BL21/pET28a克隆的可溶性提取物，泳道3和4分别为E.coli BL21/pET28a-VP2克隆的可溶性提取物；并证实VP2亚单位疫苗能有效保护鸡受到高致病性传染性法氏囊病病毒的侵袭。然而，现有技术中存在以下两种问题:

[0007] 1、现有技术所得到的VP2蛋白多以包涵体形式存在，生产成本高。[0008] 2、现有技术纯化后的蛋白中内毒素含量高，会引起严重的负反应。

发明内容

[0009] 因此，本发明要解决的技术问题是:

[0010] 1、减少包涵体的形成，增加VP2蛋白的可溶性表达的量，降低生产成本。

[0011] 2、采用新的纯化技术减少VP2蛋白中内毒素的含量，降低负反应。

[0012] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，将鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA克隆到表达载体中，优化重组蛋白分离、纯化技术，提供一种E.Coli VP2菌种和用所述菌种生产IBD基因工程亚单位疫苗和生产IBD基因工程疫苗的方法及应用。

[0013] 本发明首先要解决的技术问题是将鸡传染性法氏囊病病毒VP2cDNA克隆到表达载体中，提供一种适合在大肠杆菌中高效表达的鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2 cDNA。

[0014] 本发明提供了一种DNA序列，所述序列实质上编码含有SEQ.N0.2的氨基酸序列，本发明中的术语“实质上含有”是指本发明的基因或多肽在保持其功能的范围内，序列号I的核酸序列，序列号2的氨基酸序列可以发生置换、插入或缺失等变异。

[0015] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供一个含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的大肠杆菌表达载体及含有所述表达载体的大肠杆菌，并能表达SEQ ID NO:2所不氨基酸序列的蛋白质，与Genebank公布的超强毒株VP2基因序列同源性较高。

[0016] 本发明所要解决的第一个技术问题是通过以下技术途径实现的:

[0017] —种重组大肠杆菌表达载体,含有IBDV VP2基因核苷酸序列。

`[0018] 本发明提供了一种重组DNA表达载体，所述DNA表达载体的多克隆位点间包含所述实质上编码含有SEQ.N0.2的DNA序列，所述表达载体包括pCold III表达载体。

[0019] 本发明的重组大肠杆菌表达载体可通过本领域的常规方法构建而成，即将IBDVVP2基因插入到大肠杆菌表达载体合适的限制性内切酶位点之间，使IBDV VP2基因可操作的与大肠杆菌表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将IBDVVP2基因核苷酸序列插入到大肠杆菌表达载体pCold III的多克隆位点之间，使所述核苷酸序列位于冷休克基因(CspA)启动子和lac Z启动子的下游并受其调控，得到重组大肠杆菌表达载体。

[0020] 本发明所述构建的重组大肠杆菌表达载体可通过常规的方法转化宿主细胞，所述的宿主细胞类型可为DH5c1、BL21。作为本发明的一个优选的实施方案，优选为将重组大肠杆菌表达载体采用CaCl2转化方法转化BL21 (DE3)大肠杆菌株(E Col1.BL21 (DE3))。

[0021] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供一种鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白，所述重组蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物学活性和免疫原性。

[0022] 本发明提供了一种鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白，所述蛋白实质上含有SEQ.N0.2的氨基酸序列。

[0023] 本发明所要解决的第二个技术问题是通过以下技术途径实现的:

[0024] 一种鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白，所述重组VP2蛋白主要由IBDV VP2基因核苷酸序列所编码。

[0025] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供一种制备鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白的方法。[0026] 本发明提供了一种制备鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白的方法，所述方法包括以下步骤:

[0027] 用所述的重组DNA表达载体转化大肠杆菌，诱导所述重组VP2蛋白的表达，回收并纯化表达的所述重组VP2蛋白；

[0028] 其中，所述大肠杆菌包括DH5 a、BL21。

[0029] 本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种纯化鸡传染性法氏囊病病毒重组抗原蛋白的方法，所述方法能有效地清除重组抗原蛋白中的绝大部分内毒素。

[0030] 纯化所述重组抗原蛋白的方法包括以下步骤:

[0031] 将表达的所述重组抗原蛋白溶液和终浓度为1%的Triton X-114涡旋振荡；所述溶液混匀后在冰上放置5分钟，冷却后，所述溶液立即放入37°C水浴中温浴5min，使得所述溶液产生新的两相；然后所述溶液在37°C离心60s ;离心过后，吸取所述溶液上部水相，使用所述水相再次用Triton X-114提纯,整个操作循环3次。

[0032] 本发明所要解决的第五个技术问题是提供一种含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物，其中，所述疫苗组合物中内毒素含量为l(Tl00EU/ml。

[0033] 优选地，所述鸡传染性法氏囊病毒亚单位抗原为免疫量的重组VP2蛋白，所述疫苗组合物包括佐剂；更优选地，所述的重组VP2蛋白AGP抗原效价在1:8-1:64之间，所述佐剂为油佐剂。

[0034] 本发明提供的所述的亚单位基因工程疫苗组合物可进一步包含其他抗原，所述抗原包括鸡新城疫抗原、鸡传染性支气管炎抗原。

[0035] 本发明所述重组VP2蛋白可按照本领域常规的方法制备成蛋白亚单位基因工程疫苗。`

[0036] 本发明提供了一种制备含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物的方法，用PBS磷酸盐缓冲液将所述重组VP2蛋白溶液稀释至600 μ g/mL,然后将所述重组蛋白溶液与佐剂按1:2的比例混匀，乳化。

[0037] 本发明提供了一种含鸡传染性法氏囊病病毒亚单位抗原的疫苗组合物预防和治疗鸡传染性法氏囊病的应用。

[0038] 本发明提供的所述的亚单位抗原的疫苗组合物能够有效地防治鸡传染性法氏囊病，并显著减少了疫苗组合物中内毒素的含量，明显降低鸡个体的副反应，大大提高了疫苗的安全性。

附图说明

[0039] 图1为现有技术中重组VP2的Western-blotting分析；

[0040] 图2为内毒素检测标准曲线图；

[0041] 图3为Triton X-114清除粗提VP2蛋白中内毒素效果图；

[0042] 图4为IBDV-VP2基因工程亚单位疫苗对鸡的体重增加的影响；

[0043] 图5为内毒素清除与否对实验动物的体重增加的影响；

[0044] 图6为IBDV-VP2基因工程亚单位疫苗与其它疫苗联合使用对鸡只体重增长的影响。

[0045] 附图标记[0046] 图1蛋白免疫印迹分析重组蛋白，蛋白条带用辣根过氧化物酶标签显色，泳道I和2分别为E.coli BL21/pET28a克隆的可溶性提取物，泳道3和4分别为E.coli BL21/pET28a-VP2克隆的可溶性提取物。

具体实施方式

[0047] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0048] 实施例1:pCold III _IBDV_VP2表达体系的构建

[0049] 1、实验材料

[0050] 质粒提取试剂盒购自天根生物；T4 DNA Ligase购自BioLab ;EcoRl、Sail限制性内切酶、pCold III _DH5 α菌株购自TaKaRa ;琼脂糖凝胶胶回收试剂盒购自天泽生物，其他试剂均为分析纯。

[0051] 2、实验步骤

[0052] 2.1VP2 cDNA 制备

[0053] 2.1.1 总 RNA 的提取

[0054] 总RNA简要过程如下:将感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒LQ9株的SPF鸡法氏囊用研磨器研磨。取200 μ L病料补加TE (IOmM Tris, ImM EDTA，ρΗ8.0)至500 μ L，加入5yL蛋白酶K和10% (W/V)十二烷基磺酸钠(SDS)50 μ L，56°C水浴3小时。加入等体积苯酚/氯仿(1: 1，V/V)抽提3次，等体积氯仿抽提一次。移出上清至另一 1.5mL离心管，加入1/10体积的NaAc (3M, pH5.2)、等体积异丙醇，_20°C沉淀2小时。4°C、10000转/分离心15分钟，用75%乙醇洗一次。真空干燥，将RNA用无RNA酶去离子水0.5ml重新溶解。

[0055] 2.1.2 VP2 cDNA 制备

[0056] 根据VP2基因5’和3’末端的保守区序列合成寡聚核苷酸引物，每个引物的5’端包含一个方便将基因克隆到载体上的限制酶切位点。这对引物被用来进行RT-PCR扩增生成cDNA。合成寡聚核苷酸引物序列如下:

[0057] VP2-EcoRl-f:CCGGAATTCATGACAAACCTGCAAGATCAAAC

[0058] VP2-Sall-r:ACGCGTCGACTTACCTTAGGGCCCGGATTATGT

[0059] 2.2含酶切位点的VP2片段扩增

[0060] 对上述制备的VP2 cDNA进行PCR扩增，并利用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒回收，-20°C保存。

[0061] 2.3pCold III质粒 EcoRl、Sall 双酶切

[0062] 利用EcoRl、Sail对pCold III质粒进行双酶切，形成具有粘性末端的连接片段，反

应体系如下:

[0063]

[0064] 37°C水浴2h后，琼脂糖电泳回收1.7kb大小的目的片段。

[0065] 2.4目的基因片段的琼脂糖凝胶回收

[0066] 1.从琼脂糖凝胶中切下含有目的条带的凝胶块，放入1.5ml离心管中，称重。

[0067] 2.每IOOmg琼脂糖凝胶加入300 μ I溶胶溶液。

[0068] 3.55°C温浴lOmin，至凝胶完全融化。

[0069] 4.取700 μ I融化的凝胶溶液转移至纯化柱中，1000Og室温离心lmin。

[0070] 5.将纯化柱放回收集管中，加入500 μ I洗涤缓冲液，1000Og室温离心lmin。

[0071] 6.弃去滤过液，纯化柱放回收集管，再次离心lmin，再次离心lmin，以除去残留的Washing Buffer。

[0072] 7.将纯化柱转移至1.5ml新的微量离心管中，在柱子中央加入30~50 μ I洗脱缓冲液，1000Og室温离心lmin。离心管中洗脱液即为回收的DNA。

[0073] 2.5酶连反应

[0074] 1、取约10 μ I经过酶切和纯化的pCold III载体，加入30 μ I的待插入片段。

[0075] 2、加入I μ I Τ4 DNA连接酶，漩涡混匀，室温离心数秒。

[0076] 反应体系如下:

[0078] 3、20-25°C孵育连接2小时后可以取20 μ I直接转化大肠杆菌BL21 (DE3)，并涂布在含有100 μ g氨苄青霉素LB固体培养基中培养过夜，长出的菌落即为阳性克隆，命名为pCold III _VP2/E.Coli BL21 (DE3)菌株。挑取单克隆在含有100 μ g氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后，送Invitrogen公司测序分析,测序结果通过BLAST (http://blast, ncb1.nlm.nih.gov/)分析显不前期扩增的VP2基因序列与Genebank公布的IBDV超强毒株VP2基因序列同源性较高，能达到98%。

[0079] 实施例2:IBDV VP2蛋白制备

[0080] 1、实验材料:pCold II1-VP2/E.Coli BL21 (DE3)菌株、IPTG、PBS。

[0081] 2、实验方法

[0082] 2.1准备含50-100 μ g/ml氨苄青霉素的LB培养基。

[0083] 2.2.将含有实施例1中制备的pCold II1-VP2/E.Coli BL21 (DE3)菌株接种到培养基中，接种量为1% (V/V)，37°C振荡培养。[0084] 2.3.当 0D600=0.4-0.6 时，于 15°C 放置 30 分钟。

[0085] 2.4.加入异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，使其终浓度为0.1-1.0mM，15°C振荡培养24小时。

[0086] 2.5.培养结束后，收集菌体，并用PBS (氯化钠，8g，氯化钾，0.2g，磷酸氢二钠，

1.44g，磷酸二氢钾，0.24g，调pH 7.4，定容1L)重悬菌体，超声破碎，离心取上期琼脂糖扩散实验分析VP2抗原含量。

[0087] 3、实验结果

[0088] 表达产物中的VP2 AGP抗原效价在1:64，内毒素含量高达48827EU/ml。

[0089] 实施例3:大肠杆菌表达VP2蛋白内毒素清除

[0090] 1、实验材料:

[0091] 实施例2制备的抗原；内毒素检测鲎试剂盒、内毒素标准品，购自厦门鲎试剂公司，其他试剂均为分析纯。

[0092] 2、实验方法

[0093] 2.1 Triton X-114清除粗提VP2蛋白中内毒素方案

[0094] 1.5ml离心管中加入0.5ml待处理溶液和终浓度为1% (v/v)的曲拉通X-114 (Triton X-114) (·5 μ 1)，涡旋振荡。样品在冰上放置5分钟，。涡旋振荡冷却的样品后，离心管立即放入37°C水浴中温浴5min，使得产生新的两相。然后，把样品在37°C离心60s。离心过后，目的蛋白将留在上层，而含有内毒素的洗涤剂将会以油滴的性状残留在离心管底部。整个操作循环3次。

[0095] 2.2洗涤剂Triton X-114对VP2蛋白免疫原性的影响

[0096] 洗涤剂Triton X-114对VP2蛋白免疫原性的影响是利用琼脂糖扩散试验进行分析。

[0097] 2.3内毒素检测

[0098] 用试剂盒检测样品中内毒素含量，具体步骤按试剂盒说明进行，实验同时分析了未处理样品、经过1、2、3个Triton X-114相分离循环后的样品的内毒素含量，每组两个样品，并以内毒素检测用水为阴性对照，以内毒素标准样品为标准，绘制标准曲线进行定量分析。

[0099] 3、实验结果

[0100] 3.1内毒素清除实验

[0101] 请参见图2，根据内毒素标准品绘制了标准曲线，其中R2=0.98符合要求(R2 ( 0.98)，因此检测结果成立。

[0102] 内毒素标准品被梯度稀释为lEU/mL、0.5EU/mL、0.25EU/mL和0.lEU/mL,鲎试剂试剂盒检测545nm处吸光值，并通过Excel绘制标准曲线。

[0103] 接着，根据标准曲线定量了样品中内毒素的含量，请参见图3，粗提VP2蛋白液在4°C时加入1%的Triton X-114,后升温至37°C进行相分离,操作重复3次,每次操作后取样进行内毒素检测；结果显示经过I次Triton X-114相分离处理后，样品中99.99%的内毒素被清除了，经过2次循环后样品中内毒素的含量减少到0.3EU/ml左右。结果表明TritonX-114能够清除重组蛋白中残留的内毒素。

[0104] 3.2洗涤剂Triton X-114对VP2蛋白免疫原性的影响[0105] 内毒素是大肠杆菌表达系统中最常见、最主要的污染物。在重组蛋白中存在少量的内毒素就能引起机体产生明显的负反应。在这里我们利用非离子型表面活性剂TritonX-114形成的双水相结构清除重组蛋白中的内毒素污染，并分析了内毒素洗涤剂TritonX-114对VP2蛋白免疫原性的影响，结果显示洗涤前后VP2蛋白的琼扩效价没有发生明显变化，提示Triton X-114对VP2蛋白免疫原性没有影响。

[0106] 表1内毒素洗涤剂Triton X-114对VP2蛋白免疫原性的影响

[0108] 实施例4 =IBDV基因工程亚单位疫苗免疫效力检验

[0109] 1、实验材料

[0110] 实验动物采用21日龄的SPF鸡，购于北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；攻毒采用购于中监所的IBDV BC6/85强毒株，白油，购于法国埃索公司。

[0111] 2、实验方法

[0112] 2.1负反应检测

[0113] 动物实验检测:在下面的免疫效力检测实验中观察免疫后鸡的应激反应。

[0114] 2.2疫苗的制备

[0115] 水相:油相/1:2混合,乳化机以17500r/min搅拌5min,在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。其中油相为:白油:司本:硬脂酸铝/94:6:1.5(V:V:m)，油相、吐温等使用前121°C，30min灭菌，水相为:抗原:吐温/96:4 ;抗原来源自实施例3。

[0116] 2.2.1不同含量抗原对免疫效果的影响

[0117] 首先，制备了 3组(A组、B组、C组)不同含量抗原的疫苗并分析了对免疫效果的影响，抗原的AGP效价如表2所示，抗原中内毒素含量为10EU/ml，对照组D的抗原按照中国专利CN100360662C方法制备，抗原的AGP效价为1:16，内毒素含量为1000EU/ml。分别免疫21日龄SPF鸡，每组10只，免疫剂量为0.25ml/羽份。

[0118] 表2不同组含有的抗原AGP效价

[0120] 2.2.2抗原中内毒素含量对免疫负反应的影响

[0121] 接着，分析了抗原中内毒素残留量对制备了免疫负反应的影响，内毒素残留量如表3所示，抗原的AGP效价为1:16，对照组抗原按照中国专利CN，100360662C制备，抗原的AGP效价为1:16，内毒素含量为1000EU/ml。分别免疫21日龄SPF鸡，每组30只，免疫剂量为0.25ml/羽份。

[0122] 表3不同分组中抗原内毒素的残留量

[0124] 2.2.3不同方法制备的抗原免疫效果分析

[0125] 为了验证内毒素清除后的效果，按照中国专利CN100360662C制备一批法氏囊亚单位疫苗，其中A组进行纯化并，内毒素含量在l(Tl00EU/ml，B组按照中国专利CN100360662C方法制备，内毒素含量为1000EU/ml。C组为空白对照。分别免疫21日龄SPF鸡，每组10只，免疫剂量为0.25ml/羽份。

[0126] 2.3攻毒程序

[0127] 免疫接种15日后，各组进行攻毒实验，接受BC6/85攻毒，攻毒剂量为100BID。

[0128] 2.4效力检验

[0129] 2.4.1血清学方法疫苗接种后每周采血，`并分离血清，用琼脂扩散实验检测IBD抗体滴度，采血同时观察副反应。

[0130] 2.4.2攻毒检验

[0131] 免疫接种15日后，各组进行攻毒实验，经点眼途径分别攻击IBDVBC6/85强毒株病毒液，攻毒剂量为100BID (点眼滴鼻0.1mL 200U的标准毒株)。攻毒后,逐日观察鸡只临床表现，记录发病和死亡情况，剖检观察死亡鸡只法氏囊病变，96小时后扑杀全部实验动物，逐只剖检，观察记录法氏囊病变情况，并统计实验结果。

[0132] 3、结果评定

[0133] 实验结果评价主要包含:琼脂扩散抗体效价、免疫攻毒保护结果、免疫后动物应激反应情况。其中免疫攻毒保护结果的判定为:法氏囊病变，出现胸肌、腿部肌肉条状出血、法氏囊肿大、萎缩、发黄、内有胶冻样分泌物等病变。

[0134] 4、实验结果

[0135] 4.1不同抗原含量的IBDV基因工程疫苗免疫结果

[0136] 分别免疫0.25mL亚单位疫苗，3周后采血AGP检测血清中IBD效价，AGP分析结果表明3组实验组免疫组血清AGP效价都大于1: 8，对照组D、E结果均为阴性，其中B组、C组结果都优于对照疫苗。(表3)。

[0137] 表4免疫21天后琼脂平皿扩散抗体效价

[0139] 各组分别颈部皮下或腿部肌肉免疫0.25mL亚单位疫苗，3周后采血AGP检测血清中IBD效价，结果表明3组免疫组血清AGP效价都大于1:8，对照组结果均为阴性，n=10。

[0140] 点眼、滴鼻接种0.1mL/羽BC6/85强度株(购自中国兽医药品监察所)，攻毒96小时后处死。所有的组别中都包含腿肌、胸肌条状出血，法氏囊肿大或缩小、法氏囊有外渗物、内有胶冻样分泌、出血点等临床症状的一点或几点，都判定为法氏囊攻毒未保护。分析了不同组中囊体比的变化，结果显示除攻毒对照，其他组与空白对照相比都没有区别。

[0141] 4.2抗原中内毒素含量对免疫负反应的影响

[0142] 参见图4，实验动物免疫后3周内隔天称量体重，结果显示免疫纯化后抗原制备的疫苗对鸡的体重增加没有明显影响，而未处理抗原则会明显抑制鸡的体重增长，T-Test统计分析，P ( 0.05，表示两者之间有明显差异，与对照疫苗相比抗原经过纯化的疫苗体重增长也有较明显的增加。

[0143] 图4为免疫后三周体重变化趋势,实验结果显示免疫后三周免疫未清除内毒素抗原的鸡只体重增加量与对照组有明显的减少(P ( 0.05，n=30)。

[0144] 4.3不同方法制备的抗原免疫效果分析

[0145] 为了验证内毒素清除后的效果，按照中国专利CN100360662C制备一批法氏囊亚单位疫苗，经过内毒素处理为10~100EU/ml，结果显示内毒素清除后实验动物的体重增加与对照组基本相同，都明显高于未清除组，(P ( 0.05,n=10)(图5)。

[0146] 实施例5IBDV VP2基因工程亚单位疫苗与其它疫苗联合使用免疫效果检验

[0147] 1、实验材料

[0148] 实验动物采用21日龄的SPF鸡，购于北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；白油，购于法国埃索公司。

[0149] 2、实验方法

[0150] 2.1疫苗的制备

[0151] 水相:油相/1:2混合,乳化机以17500r/min搅拌5min,在终止搅拌前加入1%硫柳汞溶液，使其终浓度为0.01%。其中油相为:白油:司本:硬脂酸铝/94:6:1.5(V:V:m)，油相、吐温等使用前121°C，30min灭菌，水相为:抗原:吐温/96:4 ;抗原来源自实施例3。

[0152] 2.2IBDV VP2基因工程亚单位疫苗与其它疫苗联苗的配制

[0153] 为了分析IBDV VP2抗原与其它抗原组成联苗后的免疫效果，各组抗原含量如表1所示，其中，法氏囊抗原来源自实施例3，新城疫和鸡传染性支气管炎抗原以及对照疫苗中的法氏囊抗原参照中国专利CN，102069684A制备，分别免疫21日龄SPF XI，每组30只，免疫剂量为0.25ml/羽份。

[0154] 表5 IBD VP2亚单位单苗与新城疫、鸡传染性支气管炎联苗.