Nature Methods | 老树发新芽：荧光原位杂交再出发

从上世纪70年代开始发展出了荧光原位杂交技术（Fluorescence in situ hybridization，FISH），为人们检测固定样本中核酸的定位与丰度提供了极为重要的工具【1】。虽然最近在FISH的信号扩增与多种颜色共同使用方面已经有了一定的进展，但是如何能够很大程度上扩增FISH信号强度，如何高效率顺序标记不同的靶标以及如何减少实验步骤的繁杂程度仍然是亟需解决的问题。

为了进一步优化FISH的信号，2019年5月21日，HHMI的Constance L.Cepko研究组与哈佛医学院的Peng Yin研究组在Nature Methods上合作发文SABER amplifies FISH: enhancedmultiplexed imaging of RNA and DNA in cells and tissues，该文章所提出的新颖优化手段为FISH技术的应用提供了更为广阔的空间。

以往的研究中已有一些技术对FISH的信号进行扩增，比如杂交链式反应(Hybridization chain reaction, HCR)【2】，能够有效地对组织中的靶标进行标记和扩增，HCR使用成对的自折叠发夹结构的寡核苷酸引起自组装的连环链，以实现原位无酶信号扩增。但是，到目前为止，只有5种HCR的串联体被证实可用，可能是由于发夹结构设计过于复杂而且涉及到的动力学过程也很不清楚。

那么，FISH信号的最理想优化扩增方法是什么样的呢？Cepko研究组与Yin研究组列出了大家对于该实验的需求：1）信号扩增要高水平和高可控性；2）能够用于同时标记多种FISH信号；3）标记效率高，即使是用于较厚的样品也能够有很高的标记能力；4）步骤简单易行；5）性价比要高并且试剂都很容易获得。

为了进一步优化FISH信号并满足以上条件，研究人员将交换反应信号扩增（Signal amplification by exchange reaction, SABER）技术引入FISH中，将普通的FISH探针加上长单链DNA串联体，在串联体上聚集多个互补荧光成像链以扩增FISH信号。

在SABER技术中，需要用到人工合成单链DNA的方式。Yin研究组在2018年时建立非常有效的引物交换反应（Primer-exchange reaction, PER）【3】，为体外合成目的长度的串联体奠定了基础。引物交换反应之后的串联体用9个核苷酸的引物进行化学扩增延长，延伸后的探针与样品进行杂交后，再使用荧光成像的寡核苷酸进行二次杂交，从而扩增FISH信号（图2）。

图2 SABER工作流程图

为了验证SABER-FISH技术的信号特异性与实用性，Cepko研究组与Yin研究组首先在体外培养的细胞中检测SABER对于FISH信号的作用。PER扩增后的探针标记出的信号比未使用PER扩增的探针无论是在DNA FISH或者是RNA FISH的信号均有很大的提升（图3）。因此，SABER对于FISH的信号强度能够显著提高。

图3 SABER技术能够显著扩增FISH信号

那么SABER技术对于固定的组织是否也具有相似的信号提升作用呢？在对不同厚度的小鼠视网膜组织切片中进行FISH实验后发现，SABER技术对于小鼠视网膜中的FISH信号放大也起着重要的促进作用（图4）。

图4 在小鼠的视网膜组织中使用SABER技术扩增FISH信号

同时，作者们为了进一步验证能否使用SABER-FISH技术多色标记不同的靶标，并且同时也能提高FISH的信号强度。作者们首先在染色体分散的实验中对SABER-FISH进行检测，发现能够使用6种颜色单独或者进行颜色组合对组织中的不同基因位点进行标记，能够至少标记出人类X染色体上17个探针的位置与信号丰度，并且荧光强度也足够强（图5）。在小鼠的视网膜组织也能够得到类似的多种信号组合同时进行信号放大的效果。还可以建立体内RNA的报告子，用于检测检测增强子的活性。

图5 人类X染色体的模式图（a）与17个探针顺序标记X染色体的SABER-FISH信号图

总的来说，Cepko研究组与Yin研究组关于SABER-FISH技术的进一步扩展，满足了目前对于荧光原位杂交技术使用方面的需要。在扩增FISH信号强度的同时，能够使用多种探针对染色体上的不同位置同时进行标记，而且由于只是重复杂交的步骤，使得试剂使用方面非常经济，操作步骤也很简单。该信号扩增技术对于荧光原位杂交技术的广泛使用提供了更为广阔的可能性。