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“莱博” 整体课题综合解决方案、动物实验、外泌体实验、甲基化测序、细胞自噬等实验任你选择 环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，主要位于细胞质或储存于外泌体中，不受RNA外切酶影响，表达更稳定且不易降解，已被证明广泛存在于多种真核生物体内，近年来是RNA领域的研究热点。 这次分享的是发表在Autophagy（IF=11.059）上的文章，研究发现在肺癌中circHIPK3参与调控自噬通路。 文章题目：Circular RNA circHIPK3 modulates autophagy via MIR124-3p-STAT3-PRKAA/AMPKα signaling in STK11 mutant lung cancer. 主要研究结果： 1、circHIPK3在肺癌细胞中广泛表达； 2、干扰circHIPK3抑制细胞增殖和侵袭； 3、circHIPK3参与调控细胞自噬； 4、circHIPK3通过MIR124-3p/STAT3/PRKAA通路影响细胞自噬； 5、肺腺癌中circHIPK3:linHIPK3与患者预后有关； 6、circHIPK3调控细胞自噬的机制模型。 1、circHIPK3在肺癌细胞中广泛表达 circHIPK3在肺癌细胞中广泛高表达，主要定位于胞质中，而LinHIPK3在细胞核中更丰富。为分析circHIPK3的功能和机制，作者设计并验证了特异性靶向circHIPK3的siRNA（si-circ-1和si-circ-2），靶向linHIPK3的siRNA（si-lin），以及靶向circHIPK3和linHIPK3的siRNA（si-both），经验证这些siRNA都可以有效的对靶分子产生干扰作用。 2、干扰circHIPK3抑制细胞增殖和侵袭 将si-ctr、si-circ-1、si-circ-2、si-lin、si-lin转染肺癌的不同细胞中（A549、H838、 H1299），通过分析细胞增殖曲线，克隆形成及细胞侵袭等实验；发现干扰circHIPK3可显著抑制细胞增殖、侵袭及克隆形成，但干扰linHIPK3没有明显变化。 3、circHIPK3参与调控细胞自噬 A549细胞和H838细胞中干扰circHIPK3可显著增强LC3B-I，降低p62（SQSTM1），表明可显著诱导细胞自噬。但在H1299细胞中，这一现象却并不明显；A549和H838中干扰circHIPK3可同时增加自噬体和自噬溶酶体的数量，说明干扰circHIPK3能够诱导自噬，但干扰linHIPK3却导致自噬流下降；Si-both则逆转干扰linHIPK3的现象。在H1299细胞中，干扰circHIPK3和linHIPK3均降低自噬流。 用细胞自噬抑制剂（3-MA和Bfa-1），分别处理细胞A549和H838，干扰circHIPK3后细胞增殖的影响减弱，说明在这两种细胞中干扰circHIPK3导致的细胞增殖抑制的确与细胞自噬有关。但在H1299细胞中，两种药物处理后不能逆转干扰circHIPK3抑制增殖的现象。这些发现表明circHIPK3部分通过细胞自噬作用影响细胞增殖。 4、circHIPK3通过MIR124-3p/STAT3/PRKAA通路影响细胞自噬 已知：MIR124-3p是有抑癌功能的miRNA，circHIPK3中存在MIR124-3p的结合位点，同时，MIR124-3p还可以靶向IL6R和STAT3。 作者验证了MIR124-3p/STAT3通路在circHIPK3与细胞自噬的相关性的机制，结果表明circHIPK3可通过竞争性结合MIR124-3p，促进STAT3通路的激活；三种细胞中干扰circHIPK3都可以影响STAT3的磷酸化，而干扰STAT3后三种细胞自噬均升高。 通过Western分析STK11和phospho-PRKAA/AMPKα的变化。发现干扰circHIPK3时A549 和H838中phospho-PRKAA/AMPKα增高，但在H1299中却降低。circHIPK3和linHIPK3对phospho-PRKAA/AMPKα的效应也是相反的。在A549和H838中phospho-PRKAA的水平与STAT3磷酸化水平也是负相关的。在A549和H838中干扰PRKAA后，LC3B-I增多，自噬流降低，细胞自噬受到抑制。分别干扰STAT3和PRKAA看相互影响情况，结果表明在三种细胞系中均存在STAT3对PRKAA的调控作用，而PRKAA对STAT3的调控作用仅能在A549细胞中检测出。 CCLE数据库中分析表明A549 和H838中STK11表达较低， H1299中反之。H1299中干扰STK11后，再干扰circHIPK3就可以显著提高细胞自噬。这表明H1299中出现之前的特殊现象主要是因为存在高活性的STK11，导致PRKAA的旁路激活，抵消了circHIPK3通过STAT3影响PRKAA的效应。 5、肺腺癌中C:L与患者预后有关 临床标本中分析表明，癌组织与癌旁组织中circHIPK3表达丰度相近，但线性HIPK3的表达差别较明显，癌组织中linHIPK3显著下调。通过统计C:L，发现在癌组织中这一指标显著增高，且与临床分期和预后有很高的相关性，这一比值越高，预后越差。 6、circHIPK3调控细胞自噬机制模型 通过研究并分析，作者找出了一个circHIPK3调控细胞自噬的机制模型。在A549和H838细胞中，STK11携带突变，且表达较低。circHIPK3可竞争性结合并抑制MIR124-3p，STAT3和IL6R都是MIR124-3p的靶基因。高丰度的circHIPK3吸附了MIR124-3p，导致STAT3的磷酸化水平升高和活化，STAT3负调控PRKAA的活性。PRKAA活性与细胞自噬流正相关。因此在A549和H838细胞中，通过干扰circHIPK3能够最终促进PRKAA磷酸化和细胞自噬流升高。但在H1299中，存在野生型的STK11且表达丰度较高，该基因可直接作用于PRKAA并促进细胞自噬流，在H1299细胞中，干扰circHIPK3对PRKAA影响被高活性的STK11所掩盖。 参考文献：Chen Xiuyuan,Mao Rui,Su Wenmei et al. Circular RNA modulates autophagy via -STAT3-PRKAA/AMPKα signaling in STK11 mutant lung cancer.[J] .Autophagy, 2019, undefined: undefined. 莱博科研之家 整体课题协作 |
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