 上期我们介绍了FISH实验过程中影响实验结果的因素和解决方案，今天这期解释做出结果后，显微镜阅片的方法和一些判读的技巧，还有一些特殊的案例哦，对荧光原位杂交技术的判读有兴趣的读者千万不要错过。 1.首先在HE/IHC切片上确认肿瘤区域； 2.在10×物镜下，于FISH标本上找到与HE染色切片上相同的组织细胞结构； 3.在40×物镜下扫描整张切片，观察是否存在异质性，要求至少找到2个浸润癌区域，计数至少20个浸润癌细胞。满意的标本应是75%以上癌细胞核中有杂交信号； 4.在100×物镜下观察癌细胞核的FISH结果进行信号计数，注意上下调整焦距，以免遗漏信号。 1.因操作等原因，细胞核被损坏，边界不完整； 2.组织过度消化，细胞核边界不完整，DAPI染色浅； 3.组织消化不足，25%以上的细胞核无信号； 4.自发荧光很强或细胞核分辨差，10%细胞核外有信号。 1.计数区域可结合苏木精伊红染色进行肿瘤细胞标识； 2.选择具较好核分界的区域，要求细胞核大小基本一致、边界完整，DAPI染色均匀、核无重叠，绿色着丝粒信号清晰； 3.随机计数确定的肿瘤区域中20～30个细胞核中的双色信号，不要主观选择信号多的核计数； 4.不要计数仅显示一种颜色信号的细胞核； 5.避免计数分裂像的细胞核或被细胞核分裂及边界不完整核； 6.如果2个同样大小的橘红信号之间距离不足一个常规橘红信号大小，只计为一个信号（对于断裂探针来说，红绿信号之间距离小于一个信号大小，即为未发生断裂）； 7.若红、绿两信号的比值>20或众多信号连接成簇时可不计数，视为基因成簇扩增； 8.若为临界值，则需要再计数20个细胞核中的信号或由另外一个观察者重新计数，如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明，或换其它方法或其它蜡块重新检测； 9.若基因异常（扩增或缺失）在不同癌细胞中存在异质性时，应在另一癌区域再计算20～30个癌细胞核中的红、绿信号值，报告其最大值，并加以注释； 10.判读时可以将组织中的正常细胞(如成纤维细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、正常乳腺上皮细胞)的红绿信号作为内对照。 （PS：外周血/骨髓血滴片样本方法类似，不做详细说明） 基因融合：FISH检测探针为一个基因标记绿色，另外一个基因标记红色。 以BCR/ABL（DF）融合基因检测探针（用于BCR/ABL基因融合的检测，含GSPBCR和GSP ABL两个探针，BCR标记绿色，ABL标记红色）为例。 BCR/ABL（DF）融合基因检测探针（判读可类推其余双色双融合探针） ①探针设计：ABL基因标记红色，BCR基因标记绿色 ②正常信号细胞：2O2G 典型异常（阳性）信号细胞：1红1绿2融合，可能出现n红m绿k融合（n、m和k均≥1）的阳性信号情况 ※示意图标出的大小红绿信号点是理论上的，实际情况不一定能如此明显观察到。对于1红1绿1融合的异常信号，因可能是空间构象（信号单纯重叠）导致，所以一般单独计数，且阳性阈值明显高于其他异常情况。 ④计数判读：计数200 个细胞，出现2红2绿 信号类型的细胞记为FISH 阴性细胞，出现可能出现n红m绿k融合（n、m和k均≥1，1红1绿1融合的单独统计）信号类型的细胞记为FISH 阳性细胞 a) 若出现FISH 阳性细胞的比例大于阴性阈值时，判断为FISH 阳性； b) 若出现FISH 阳性细胞的比例小于阴性阈值时，判断为FISH 阴性； c) 若出现FISH 阳性细胞的比例等于阴性阈值时，应加大计数数目或分析整张片子（≥500个细胞），如果仍小于或等于阴性阈值，视为FISH 阴性；否则视为FISH 阳性。 ⑤计数及判读注意： a) 若无特殊情况，计数时只计数nOmGkF（n≥1，m≥1）的信号； b) 若有特殊情况，某一特殊信号出现比例20%以上，最好查阅文献或相关材料验证，； c) 红绿信号都出现的方可统计，若出现大比例（20%以上）没有红色或没有绿色或两者都无的情况，可能是样本或实验条件影响，最好用杂交信号很好的样本行对照再做。 ⑥举例：计数时同一信号类型的细胞可用“正”计数表示（温馨提示：为提高效率，针对常见信号类型和阴性细胞可用计数器进行计数，而不常见或类型较少用正号记录） 计数情况：
结果： 1O1G2F阳性细胞比例=150/（55+150+5）=71.4%，大于阈值，BCR/ABL融合阳性 此例样本为BCR/ABL基因融合 ⑦阈值参考：阴性阈值A和阴性阈值B分别为12%和2%。 基因断裂： FISH检测探针为断裂的两端（各几百kb）标记不同的颜色（红和绿）。 以MLL（又名KMT2A）基因断裂检测探针（用于MLL基因断裂的检测，含GSPMLL一个探针，断裂两端标记红绿两种颜色）为例。 MLL基因断裂检测探针（含对照，判读可类推其余断裂探针） ①探针设计：MLL断裂两端标记红绿两种颜色 ②正常信号细胞：2F（融合） 典型异常（阳性）信号细胞：1红1绿1融合，可能出现n红m绿k融合（n和m≥1）的阳性信号情况 ④计数判读：计数200 个细胞，出现2红2绿信号类型的细胞记为FISH阴性细胞，出现可能出现n红m绿k融合（n和m≥1）信号类型的细胞记为FISH阳性细胞 a) 若出现FISH阳性细胞的比例大于阴性阈值时，判断为FISH阳性； b) 若出现FISH阳性细胞的比例小于阴性阈值时，判断为FISH阴性； c) 若出现FISH阳性细胞的比例等于阴性阈值时，应加大计数数目或分析整张片子（≥500个细胞），如果仍小于或等于阴性阈值，视为FISH阴性；否则视为FISH阳性。 ⑤计数及判读注意： a) 若无特殊情况，计数时只计数nOmGkF（n≥1，m≥1）的信号； b) 若有特殊情况，某一特殊信号出现比例20%以上，最好查阅文献或相关材料验证，如ALK断裂可能出现1F1O（1融合1红）不典型异常的断裂阳性信号； c) 红绿信号都出现的方可统计，若出现大比例（20%以上）没有红色或没有绿色或两者都无的情况，可能是样本或实验条件影响，最好用杂交信号很好的样本行对照再做。 ⑥举例：计数时同一信号类型的细胞可用“正”计数表示（温馨提示：为提高效率，针对常见信号类型和阴性细胞可用计数器进行计数，而不常见或类型较少用正号记录） 计数情况：
结果： 1O1G1F阳性细胞比例=150/（55+150+1）=72.8%，大于阈值，MLL断裂阳性 此例样本为MLL基因断裂 ⑦阈值参考：参考文献，断裂阈值10%。 基因缺失：这些染色体片段和基因的缺失，FISH检测探针为某个染色体片段（几百kb长），可能会设置相应的着丝粒探针或区域片段探针作为对照。 以7q基因缺失检测探针（用于7q-的检测，含GSPD7S486和CSP7两个探针，CSP7为对照）和MM组合试剂盒中的P53/D13S319杂交液（用于P53基因和D13S319片段缺失的检测，即检测17p-和13q-，含有GSP P53和GSP D13S319两个探针，都具有检测意义）为例。 1.7q缺失检测探针（含对照，判读可类推5q-、6q-、P53和ATM等基因缺失检测探针） ①探针设计：D7S486标红色，CSP17（17号着丝粒探针）标绿色 ②正常信号细胞：2红2绿 典型异常（阳性）信号细胞：1红2绿（7号染色体长臂缺失），1红1绿（整个7号染色体缺失，当然长臂也缺失） ③计数判读：计数200 个细胞，出现2红2绿信号类型的细胞记为FISH 阴性细胞，出现1红2绿 或1红1绿 信号类型的细胞记为FISH阳性细胞 a) 若出现FISH 阳性细胞的比例大于阴性阈值时，判断为FISH 阳性； b) 若出现FISH 阳性细胞的比例小于阴性阈值时，判断为FISH 阴性； c) 若出现FISH 阳性细胞的比例等于阴性阈值时，应加大计数数目或分析整张片子（≥500个细胞），如果仍小于或等于阴性阈值，视为FISH 阴性；否则视为FISH 阳性。 ④计数及判读注意： a) 若无特殊情况，计数时只计数2G2O、2G1O和1G1O的信号； b) 若有特殊情况，某一特殊信号出现比例20%以上，最好查阅文献或相关材料验证； c) 红绿信号都出现的方可统计，若出现大比例（20%以上）没有红色或没有绿色或两者都无的情况，可能是样本或实验条件影响，最好用杂交信号很好的样本行对照再做。 ⑤举例：计数时同一信号类型的细胞可用“正”计数表示（温馨提示：为提高效率，针对常见信号类型和阴性细胞可用计数器进行计数，而不常见或类型较少用正号记录） 计数情况：
结果： 2G1O阳性细胞比例=150/（55+150+1）=72.8%，大于阈值，7q-阳性 1G1O阳性细胞比例=1/（55+150+1）=0.5%，小于阈值，-7阴性 此例样本为7q-阳性 ⑥阈值参考：参考文献，阈值6%。 基因扩增：FISH检测探针为某个染色体或基因片段（几百kb长），可能会设置相应的着丝粒探针（2-3Mb长）或区域片段探针作为对照。 以MYC基因扩增检测探针（用于MYC基因扩增的检测，含GSPMYC和CSP8两个探针，CSP8为对照）和MM组合试剂盒中的RB1/1q21杂交液（用于1q21扩增和RB1缺失的检测，含有GSP1q21和GSP RB1两个探针，都具有检测意义）为例。 1.MYC基因扩增检测探针（含对照，判读可类推TERC、GLI1等基因扩增检测探针） ①探针设计：MYC标红色，CSP8（8号着丝粒探针）标绿色 ②正常信号细胞：2红2绿 典型异常（阳性）信号细胞：n红m绿（n≥3，若m≥3时，8号染色体多体） ③阈值设定：随机选取10 例以上的正常骨髓细胞涂片或者正常外周血细胞涂片当阴性质控片，每张阴性质控片随机计数200 个细胞，分别计算出现各类型FISH 阳性细胞的数目及百分比，统计百分比的平均值及标准差，阴性阈值设定为平均值+3 倍标准差。 ④计数判读：计数200 个细胞，出现2红2绿信号类型的细胞记为FISH阴性细胞，出现n红m绿 （n≥3）信号类型的细胞记为FISH阳性细胞 a) 若出现FISH 阳性细胞的比例大于阴性阈值时，判断为FISH阳性； b) 若出现FISH 阳性细胞的比例小于阴性阈值时，判断为FISH阴性； c) 若出现FISH 阳性细胞的比例等于阴性阈值时，应加大计数数目或分析整张片子（≥500个细胞），如果仍小于或等于阴性阈值，视为FISH阴性；否则视为FISH阳性。 ⑤计数及判读注意： a) 若无特殊情况，计数时只计数nOmG（n≥2，m≥2）的信号； b) 若有特殊情况，某一特殊信号出现比例20%以上，最好查阅文献或相关材料验证； c) 红绿信号都出现的方可统计，若出现大比例（20%以上）没有红色或没有绿色或两者都无的情况，可能是样本或实验条件影响，最好用杂交信号很好的样本行对照再做。 ⑥举例：计数时同一信号类型的细胞可用“正”计数表示（温馨提示：为提高效率，针对常见信号类型和阴性细胞可用计数器进行计数，而不常见或类型较少用正号记录） 计数情况：
结果： 3O阳性细胞比例=（150+1）/（55+150+1）=73.3%，大于阈值，MYC基因扩增阳性 此例样本为MYC基因扩增阳性，8号染色体多倍体 ⑦阈值参考：参考文献，MYC扩增阈值4%。 案例一： 在脑胶质瘤中的1p和19q探针中，1p的结果图如下： 按照大部分缺失探针的惯有判读经验，红色信号点小于两个才是缺失，而该样本红色平均都有2个，是不是不算缺失呢？ 我们先看一下探针的标记图： 红色信号是1p36，绿色是1q21，绿色是作为红色有没有缺失的内对照，所以不能单纯只看红色信号点有没有少于两个，正确的判读方式是： 1p（红）/1q（绿色）＜0.75或阳性细胞比例（红色信号小于绿色信号的细胞）大于50%即为阳性。 按照这个判读，该例样本计数100个细胞，红色信号数293，绿色信号数434，1p（红）/1q（绿色）=0.67＜0.75，该样本1p缺失判为阳性。 案例二： 在一例怀疑黏液样脂肪肉瘤的患者的样本里，杂交了DDIT3(CHOP)探针，出来的结果图为： 这是一个断裂探针，按照道理应该是看是否有红绿信号分离，从而判读有没有断裂，可是这个样本居然出现了绿色成簇，红绿信号却没有分离，这到底怎么回事呢？ 我们先看一下探针的位点图：
DDIT3探针标记在12q13.3-12q14.1这个位置，而基因MDM2在12q15位置，12q13-15在脂肪肉瘤（特别是去分化或高分化脂肪肉瘤）较常发生扩增。 所以该样本的扩增可能是MDM2基因扩增造成的，后来我们重新杂交了MDM2基因，出现了下面的结果图：
故该样本为MDM2扩增阳性，DDIT3断裂阴性。 案例三： 我们一例血液的标本，杂交了CBFβ断裂探针，结果图如下：
经过计数，信号及比例为：正常的2F（2融合）为72%，1G2F（1绿2融合）的比例为24%，1O1G1F（1红1绿1融合）为3%。这个结果中，典型的红绿分离断裂阳性信号仅为3%,那该如何判读呢？我们先看探针位点图：
除了典型的红绿分离阳性信号外，还出现了比例很高的单绿2融合信号点，推测原因有两个可能，一是红色区段缺失（可能性不大），第二更大可能性是该基因在绿色的区段发生了断裂，但是是否真的有发生断裂，那就需要用融合探针做进一步的核实。 然后我们把这个样本杂交了CBFβ/MYH11探针，出来的结果图如下：
信号类型及比例为：1O1G1F比例为11%，1G2O1F的比例为25%，通过融合探针的核实就很明确知道是的确是CBFβ断裂阳性了。 |
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