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Let's start B细胞和T细胞是适应性免疫系统的两种主要淋巴细胞，它们协同工作以维持宿主防御或引起易感个体自身免疫。B细胞受体（BCR）和T细胞受体（TCR）的表型分别决定了T细胞和B细胞的表型。这两种抗原受体具有相似的结构和高度多样化的可变区。BCR (surface immunoglobulin, Ig 免疫球蛋白)是由重链(IGH)和轻链(IGL)组成的异二聚体，而αβ TCR是由TCRα和TCRβ链组成的异二聚体。每个受体都有一个高变区，包含V、D 和J基因片段，这些基因片段是从大量未排列的基因片段中随机选择的并重组形成一个互补决定区（CDR3），决定每种克隆型和抗原结合位点的特异性。从理论上讲，在骨髓B细胞和胸腺T细胞的发育过程中可以产生多达1018个独特的BCRs或TCRs。这种多样性对保护宿主免受几乎任何病原体的侵害至关重要，但它也会导致自身反应性B细胞和T细胞的产生，从而导致遗传易感个体发生自身免疫性疾病。 约翰霍普金斯大学医学院病理学系的Rizwan Ahmed等最近在《Cell》上发表的一项研究成果，最新发现了一种以前未知的淋巴细胞，它是TCR和BCR的双重表达因子(DE)，也是B细胞和T细胞的关键谱系标记，主要存在于I型糖尿病患者体内（T1D）。  研究亮点 双表达因子(DEs)是一种能同时表达BCR和TCR功能的新型淋巴细胞 在T1D(I型糖尿病)受试者中，单一BCR克隆型(x-克隆型)DEs占主导地位 x-克隆型编码一种具有HLA-DQ8最佳结合域的强效自身抗原 DEs分泌的x-单克隆抗体是胰岛素特异性CD4 T细胞的强刺激因子 实验结果 1、一个罕见的淋巴细胞亚群共表达T和B细胞谱系标记，并在T1D群体中扩增 首先，研究人员通过流式细胞术分选，发现了能同时表达TCR和BCR的细胞亚群。这类细胞主要存在于被检测个体的外周血CD5+CD19+细胞群，而且TID患者中出现DEs的频率远高于健康对照组（HC）。同时在单细胞水平上观察了DEs中IgD、IgM和TCR的共表达。因此，DEs虽然罕见，但由于其在T1D中的扩增，可能具有重要的病理生理学意义。  图1. 少数淋巴细胞同时表达TCR和BCR 2、单细胞RNA测序技术筛选出DEs中T细胞和B细胞基因的共表达谱系 然后，研究者们使用单细胞RNA测序（scRNA-seq）检测了多个细胞的转录组，结果发现DEs具有BCR和TCR的特异性表达基因和谱系标记基因。图示DEs与Tcon、Bcon细胞差异表达的前30位基因，并且筛选出DEs 和B细胞、T细胞共表达谱系标记基因。同时通过流式细胞术和荧光激活细胞分选，在蛋白水平上更加直观地观察到这些变化。 接下来，使用生物信息学软件对测序的序列进行组装，检测重组的TCR和BCR序列在DEs中的表达，与预期一致，在DEs中同时检测到了TCR和BCR的序列。使用IMGT/V- quest软件检查重建序列的V(D)J基因的使用情况，有22个DEs细胞组建了一条BCR链，18个DEs组建了两条BCR链，8个DEs组建了TCRβ链的可变区，有4个DEs将完全组装好的BCRs（重链和轻链）和TCRs（α和β链）共同表达。  图2. DEs、Tcon、Bcon细胞前30位差异表达基因 DEs与Tcon、Bcon细胞共表达基因  图3. DEs与Tcon、Bcon细胞共表达蛋白  图4. DEs中的重组TCR和BCR序列 3、DE细胞TCR和BCR组库分析--DE细胞限制TCRVβ的使用 接下来，对DEs进行分类，利用基因组DNA和免疫高通量测序(Adaptive Biotech)技术分析它们的克隆型TCRβ (TRβV)和BCR (IgHV)序列，并与传统的T细胞和B细胞序列进行比较。首先分析了来自三个T1D受试者(T1D#1、#4和#5)的8个DE样本(4个IgD+和4个IgD子集)的TRβV库，由于DEs在健康受试者中的稀缺性，仅有一名健康对照受试者(HC#1)的DE细胞满足深度测序条件。DEs显示TCRVβ基因的使用受到限制，与Tcon细胞使用55个Vβ基因相比，HC#1中的IgD+亚群仅使用7个Vβs, IgD亚群使用5个Vβs。DEs不同寻常的TCR序列提供了它们独特性的另一个证据。 4、通过对DEs的IGHV序列的分析，确定了T1D受试者中一个公共显性克隆型 将三个T1D(#1、#2、#3)受试者的IgD+、IgD DEs和Bcon细胞的IGHV与BCR基因组库进行比对分析，发现IGHV04-b基因在三个T1D受试者中占主导地位（T1D#1：95%，T1D#2：22%，T1D#3：88%），相比之下，VH04-b基因在Bcon细胞中使用的比例不到1%。  图5. DEs基因组比对结果统计 鉴于DEs中IGHV04-b基因高频出现，研究者们对它们的克隆性进行了分析。发现，IGHV04-b + DE由单个克隆型组成，其在三个受试者中使用相同的VH，DH和JH区段以及N1和N2连接，导致CDR3具有相同的核苷酸和氨基酸序列。CDR3 由重新排列的IGHV04-b、IGHD05-18和IGHJ04-01*02编码——以下称为x-克隆型。  图6. x-克隆型结构 为了确认x-克隆型的身份，研究者从T1D#1中对单个DEs进行了分类，并使用多重PCR对IGHV的表达进行了分析。在选取的所有7个DE细胞中都能够检测到确切的x-克隆型核苷酸序列，证实了高通量测序结果，鉴定了T1D＃1中95％的DE中的x-克隆型，确定x-克隆型在DEs中占主导性地位。 5、X-克隆型可使用特异性PCR探针在外周血中检测到 接下来，研究者们使用两组特异性引物检测外周血中的X-克隆型，两组都使用了相同的VH04-b基因正向引物，在第一对探针 (probe 1)中，反向引物与整个CDR3序列互补；在探针2中，使用了一个与N2-J和下游JH序列互补的反向引物。两对引物都在T1D和HC受试者中检测到x-克隆型。 所有T1D受试者携带至少一个风险等位基因（DQ2或DQ8），所有T1D受试者中至少有1例IAA呈阳性，所有HCs中IAAs呈阴性。研究者们推测，检测到携带X-克隆型+的HC受试者可能是IAA/DQ7+和高危IAA+/ b57D/+个体。未来进行扩大群体的研究可以确定x-克隆型是否可以作为T1D的生物标志物。 6、分子动力学模拟表明，x-克隆型是DQ8的最佳组合肽 最后，研究者对X-克隆型的结构和功能进行预测，并且使用蛋白分子实验和抗原-抗体结合试验进行验证。通过比对分析预测，x-克隆型可能包括一个DQ8结合表位，在P1和P9位置或有一个酸性残基(E或D)，类似于胰岛素超激动剂。为了验证这一部分预测，研究者们使用生物物理建模和分子动力学(MD)模拟了三个分子（x-克隆型、胰岛素超级激动剂和健康对照）与HLA复合物结合的稳定性，结果表明，x-克隆型（CDR3肽）比胰岛素超激动剂具有更好的结合亲和力，而健康对照破坏了HLA-β亚基的稳定性，不适合绑定。总而言之，这些结合亲和结果与体外实验结合试验结果相吻合——x-克隆型编码的CDR3肽是一种更有效的自体抗原。  图7. HLA-CDR3 肽绑定模型 结 论 新发现的DEs能够同时表达TCR和BCR，X-克隆型占主导地位，由X-克隆型编码的CDR3肽具有HLA-DQ8最强结合域，并且是一种强效的自身抗原，对CD4T细胞具有强刺激性。因此，DEs细胞内的X-克隆型可能参与了T1D患者的自身免疫。 传统的T细胞和B细胞划分并不是绝对的，违反这一范式的细胞群可能是自身免疫的驱动因素。 喜 讯 华银健康自主研发的《基于分子标记的免疫组库生物信息分析方法》发明专利获得授权！华银健康推出的全新免疫组库测序产品，其基于 5'RACE 的原理，在原始模板扩增前引入UMI序列进行文库构建，并使用具有华银健康自主发明专利的UMI标记与校正算法(发明专利号：201810618023.7)，对PCR扩增与测序过程引入的错误与偏倚进行有效纠正，极大提高分析结果的准确度。一直以来，华银健康高通量测序事业部都专注于免疫组库测序技术难题的攻克，该专利技术获得授权，标志着华银健康在免疫组库高通量测序产品研发上的重大突破，也标志着华银健康自主创新水平再上新台阶。 END |
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