【原】10X Genomics VDJ测序

    前面给大家简单的介绍了什么是免疫组库。今天小编给大家介绍一种研究免疫组库的方法。

    10X genomics单细胞VDJ测序是一种全面的研究免疫组库的方法，能够在单细胞基础上对数百个至数万个人或小鼠的T细胞和B细胞中适应性免疫反应的细胞背景和免疫组库进行同时分析。再加上Feature Barcoding技术，还能检测和分析更多的细胞数据——例如细胞表面标志物和抗原特异性等，从而加强免疫细胞表型分析，以及研究淋巴细胞和靶细胞之间的动态相互作用。目前该方法广泛的应用于：

• 揭示克隆性、多样性、抗原特异性以及细胞环境

• 对全长的V(D)J基因序列进行组装和注释

• 获得单个T细胞TCR的α链和β链的配对序列信息

• 获得单个B细胞的重链和轻链免疫球蛋白（Ig）配对序列，达到同种型分辨率

• 同时测定同一细胞的TCR、B细胞免疫球蛋白、细胞表面蛋白表达和5’基因表达

• 将配对的全长TCR α链和β链序列与TCR-pMHC特异性相关联

• 同时测定基因表达和细胞表面蛋白表达

    我们先通过下面这个视频来简单的了解一下这个技术

下面我们来具体的看一下技术细节

    首先，细胞和酶会结合凝胶珠然后包裹在油滴中，完成反转录并连接barcode来标记每一个单细胞。

    每一个凝胶珠子上带有细胞Barcode，UMI和专门为VDJ测序设计的switch oligo。

    PolyT会跟mRNA的ployA尾巴结合，并以mRNA为模板反转成cDNA，之后会在3'端加上3个C，这3个C刚好可以跟switch oligo末尾的3个G相结合。然后合成一条跟mRNA一样的链，这个时候mRNA链就带上了barcode和UMI，并且是mRNA的5'端带上了。这个过程也叫做模板转换。TSO就是template switch oglio的缩写。注意这一步跟10X mRNA建库是不一样的，传统的mRNA建库，凝胶珠子上带的oligo就是以polyT结尾的，刚好和mRNA的polyA尾结合，因此得到的是3'端的信息。而BCR和TCR的3'端为C区，一般C区很长，这样就很难测到V区和D区的相关信息了，也得不到CDR3区域的信息，因此这里需要做模板转换。

  在完成反转录和barcode连接之后，凝胶珠破裂，所有细胞的cDNA混合在一起。

  cDNA被分为两部分，一部分正常建库用于后续转录组测序。而另一部分则通过巢式PCR，有针对性的富集VDJ基因编码区域。

    巢式PCR是一种通过改变引物来达到特异性高精度富集某一个片段的PCR技术。如果第一次扩增用的引物特异性不够，会结合到除了目标序列之外的序列，那么第二次的引物，是第一次引物相邻的序列，如果第一次匹配错了，那第二次扩增的引物也能结合上的概率微乎其微。这样就能保证PCR扩增的正确性和特异性。

所以根据TCR和BCR，恒定C区的基因非常保守的原则，将C区的序列设计为引物，用相邻的outer primer和inner primer进行扩增，这样就能保证正确富集含有VDJ区域的基因了。之后会用酶进行酶切，得到不同长度的文库，然后末端修复，连上一个A，连接illumina的测序接头就可以上机测序了。

下面是最终上机测序的VDJ文库和mRNA文库

具体包括Illumina P5接头，P5测序引物，16bp Barcode，10bp UMI，13bp Template Switch oligo（TSO）序列，插入cDNA片段，P7测序引物，样本Index（i7-index read），IlluminaP7接头。通过建库，PCR扩增，上机测序等步骤，10X系统完成了对样本中存在的VDJ基因重排信息的捕捉，以便查看样本的BCR或TCR丰度和多样性。

如何获取全长VDJ序列

10X VDJ测序可以得到VDJ的全长序列，而VDJ的全长序列一般有~650bp，那么是如何通过2X150bp的reads来实现的呢？前面的原理里面提到过酶切，得到不同长度的片段，测序之后会对得到的reads进行拼接从而得到VDJ全长序列。