精准前沿丨深度解读T细胞受体测序技术研究进展|TCR|细胞|方法|测序|克隆|

本期《精准前沿》栏目分享斯坦福大学医学院Ansuman T. Satpathy教授团队发表于Nature Methods（IF = 28.547）上的一篇关于T细胞受体测序技术进展的综述[1]。T细胞介导的抗原识别取决于T细胞受体（TCR）与抗原主要组织相容性复合体（MHC）分子的相互作用。所有T细胞的TCR总和称为TCR库（TCR repertoire），每个人的TCR库是高度多样化的，这种多样化有利于识别更多的外源抗原，但同时也对利用传统方法鉴定TCR库构成了挑战，因此，亟需一种快捷高效精准的方法来研究TCR库。高通量测序技术的出现使研究人员第一次能够大批量对TCR序列进行平行分析，本文总结了将高通量测序技术和单细胞测序技术应用于TCR库的研究进展。

研究背景

T细胞受体（T cell receptor，TCR）是T细胞表面负责特异性识别与MHC（主要组织相容性复合体）结合的抗原肽的蛋白。当TCR与抗原肽和MHC结合时，T淋巴细胞通过信号转导被激活，启动免疫应答。人类基因组中有4个TCR基因：两个编码轻链TCR：TRA基因编码TCRα，TRG基因编码TCRγ；两个编码重链TCR：TRB基因编码TCRβ，TRD基因编码TCRδ；重链TCR和轻链TCR形成异源二聚体，组成完整的TCR。在人类中存在两种TCR：TCRαβ和TCRγδ，其中95％的T细胞表达TCRαβ。成熟的重链TCR基因由可变区（V）、多变区（D）、连接区（J）和恒定区（C）四部分基因片段组成（VDJC），轻链TCR则缺少D区（VJC）。重链和轻链TCR都具有3个互补决定区（CDR），CDR在抗原识别中起主要作用：CDR1和CDR2相对保守，负责识别MHC；CDR3是与抗原直接接触的TCR区域，CDR3由一部分V、全部D和J以及V-D、D-J之间连接区编码，因此CDR3变化程度最高。由于V（65~100种）、D（2种）、J（13种）基因片段本身具有多样性，此外，在重排的过程中，VD及D-J的连接区经常有非模板的核苷酸随机插入或删除，进一步增加了CDR3区的多样性，理论上会形成2×1019种TCRαβ。

由于在一个个体内几乎不会出现两个完全相同的V（D）J体细胞重排，所以TCR序列可作为T细胞克隆的独特识别标志。TCR这种特性可用于评估（1）抗原驱动的T细胞克隆扩增和反应（图1a和d）（2）纵向监测T细胞反应的克隆动态和异质性（图1b和c）（3）在单个细胞中联合评价TCR和细胞表型能够提供T细胞分化通路和T细胞选择的相关信息（图1b）。这些信息不仅有助于理解免疫相关疾病的病因学，也可用于设计治疗靶点。

TCR分析方法主要经历了三个发展阶段。早期的TCR分析方法能够揭示TCR库的基本特征，但只是获取部分序列信息，此阶段以CDR3谱型分析和利用TRBV单克隆抗体的流式细胞术为代表。随着基因组测序技术的兴起，通过分子克隆和Sanger测序能够在核苷酸分辨率水平捕获TCR信息，可更精确的评价CDR3多样性。此外，这些方法第一次实现了同时评估TCRα和TCRβ序列多样性，并且发现，在一个个体中初始T细胞库具有高度多样性而记忆T细胞对总TCR库多样性贡献较小。二代测序技术在过去二十年中发展迅速并逐渐普及，TCR检测的灵敏度和TCR发现工具性能得到极大提升。目前，在一次分析中可同时检测103-106 TCR。本综述主要讨论在细胞群体水平和单细胞水平利用高通量测序技术分析TCR库的方法学进展以及将TCR序列与抗原特异性配对的技术，并重点关注这些技术如何加深我们对于健康和疾病状态下T细胞克隆动态、分化以及反应轨迹的理解。

图1. 利用TCR多组学测序方法刻画T细胞动态

研究结果

1. TCR测序的分子策略

利用高通量测序技术进行TCR库分析，可以实现在一次实验中同时分析数以百万计的T细胞（图1a）。这些方法通常采用以下两种扩增策略中的一种：（1）多重PCR（2）5’互补端快速扩增（5’RACE）。

多重PCR

由于TCR V基因巨大的多样性，一对引物不足以捕获所有的TCR转录本，所以出现了多重PCR反应。多重PCR方法使用一组与已知V基因互补的正向引物和一组与J或C区域互补的反向引物。在这种引物扩增策略中，首先从T细胞中分离gDNA或RNA，然后采用上述引物对进行多轮PCR扩增，这些引物同时含有用于后续高通量测序的通用序列。Robins等采用这种方法进行深度CDR3β测序发现，TCR库呈现出特定V-J重排偏好。同时发现，不同个体之间初始CDR3β的重合程度远高于平均水平。这些结果表明TCR库并非随机产生的，而存在对某种重排的偏好，这可能是由于在胸腺发育过程中经历了共同抗原的缘故。

此种依赖于多重PCR扩增的方法会引入测序偏好和错误，从而无法获得TCR多样性的真实情况。目前有几种策略用于减小这种偏好，例如，由于cDNA转录本已经是经过剪切的，所以使用mRNA可以采用更少的反向引物以靶向C区域，从而降低了来自多重J引物PCR扩增的偏好性。相反，采用gDNA测序能够避免反转录，从而降低在cDNA合成过程中引入错误的可能。此外，采用合成TCR分子靶向多重引物可以在多重PCR前后定量模板，从而优化引物浓度并校正扩增偏好。

5’ RACE

第二种TCR测序方法是基于5’ RACE，这种方法需要使用具有末端转移酶活性的逆转录酶反转录RNA，从而在cDNA的3’ 端加入非模板C寡核苷酸，用于下游的cDNA扩增，非模板C寡核苷酸叫做模板转换寡核苷酸（Template switch oligo，TSO）。在第一链合成过程中，当到达 RNA 模板的 5' 末端时，逆转录酶的末端转移酶活性会在新合成的 cDNA 链的 3' 末端添加一些额外的核苷酸。这些碱基充当模板转换 (TS) 寡核苷酸锚定位点。在 TS 寡核苷酸和附加的脱氧胞苷片段之间进行碱基配对后，逆转录酶“转换”模板链，从细胞 RNA 到 TS 寡核苷酸，并继续复制到 TS 寡核苷酸的 5' 端。这种方法可以得到包含完整 5' 端的cDNA，这意味着可以保留完整的V基因序列。5’ RACE法需要较少的PCR扩增，与多重PCR法相比可以降低扩增偏好，然而这些方法仍然会存在来自PCR、模板转换以及测序的错误。

TCR扩增方法的错误矫正策略

由于上述TCR测序策略可能存在的偏好和错误，引入独特分子标签（UMIs）可以有效矫正这些错误。UMIs是一系列随机DNA序列，在cDNA合成过程中被加入cDNA中并标记唯一一条cDNA分子。这种策略有两个优势：（1）通过计数每种UMI的数目可以得到样本中TCR序列的原始分布，这有助于更精确的定量TCR克隆频率；（2）通过将具有相同UMI的reads聚集在一起可以有效矫正PCR和测序错误，从而可以推断出真实的TCR序列。由于TCRs序列之间的差异仅有几个核苷酸，这种矫正步骤可以区分真实的TCR变异和错误导致的假性多样性，所以可以更准确地评估TCR库多样性。然而，获得准确度的代价是较低的灵敏度，因为低频克隆可能由于每个UMI覆盖的read不足而被过滤掉。目前已经开发出对每个核苷酸进行错误矫正的算法，这可以更精确地测量TCR库中的克隆型频率。

TCR靶向测序方法的比较

由于TCR库测序方法不同，所以在分析测序结果时应考虑以下几个因素：首先，是采用DNA还是RNA，这决定了可以适用哪种测序方法。上述两种方法均可用于RNA，然而，如果RNA质量欠佳，则gDNA多重扩增法则可能是更好地选择（表1）。其次，TCR测序的目的也会影响测序方法的选择。例如，RNA测序结果无法直接与细胞数目相关联。所以，如果研究目标是定量某个T细胞群的克隆扩增，则gDNA法是更好的选择，因为每个细胞只有一个TCR基因组拷贝。类似地，由于多重PCR使用靶向V基因不同区域的多组引物，所以基本无法获取跨越整个V（D）J区域的全长TCR序列，这种方法足以分析具有最高变异程度的CDR3区，然而，如果拟回答的生物学问题需要评价CDR1和CDR2等其他区域，则5’ RACE法更为合适。

此外，两种TCR测序方法每一步的技术特点也会对TCR库结果和后续解释产生巨大影响。在近期一项对多重PCR和5’ RACE进行TCR测序的方法学比较研究中，Barennes等在相同的T细胞群体样本中，评价了9种TCR测序流程以比较其可重现性、可重复性以及灵敏度。他们检测到方法特异性组库特征在不同重复间，存在高度一致性，这意味着每种方法会产生特定的偏好。通过比较采用流式细胞术得到的TRB使用结果，他们观察到，相比于基于gDNA的多重PCR或5’ RACE法，基于RNA的多重PCR方法呈现出特定V基因更偏的测序结果，这可能反映了RNA转录本丰度差异引起的扩增偏好。无论采用何种方法，获得真实反映生物学免疫组库的测序结果很大程度上取决于起始核酸量，尤其是在检测罕见TCR序列方面。如果一项研究的目标是获取最大TCR多样性或检测罕见克隆型，则应优先考虑选择采用非UMI的5’ RACE法，因为这种方法比基于UMI的方法灵敏度更高，尤其是对于TCRα链。相反，如果目标是构建TCR库的代表性克隆结构或者是在扩增水平基础上识别感兴趣的TCRs，则带UMI的5’ RACE法也许更合适，因为这种方法更忠实地保留TCR克隆型频率，尽管需要几个重复或者更高的测序深度以捕获低频克隆。

以上方法均是基于细胞群体的TCR库测序，然而，这种基于细胞群体的TCR库测序方法无法分辨配对的TCRα和TCRβ，因为一次只能获取一条链。由于TCR是以二聚体的形式识别抗原的，所以这种方法限制了抗原特异性的评价。此外，TCRαβ克隆型分析更加准确，因为相同的TCRβ序列可能与不同的TCRα序列配对。所以，只考虑一条链可能低估TCR多样性、混淆克隆内表型分析以及无法准确识别免疫反应相关T细胞抗原特异性。

表1. TCR测序方法汇总

2. 配对TCRαβ的高通量测序方法

捕获配对TCRαβ测序能够更加准确地分辨TCR库中的克隆结构、评价TCR功能以及抗原特异性。捕获配对TCRαβ测序可通过两种途径实现：（1）采用基于组合的策略计算推断TCRαβ配对（2）采用分离的单细胞进行TCRα和TCRβ同时测序。

组合推断TCRαβ配对

第一种基于组合策略计算推断TCRαβ配对的方法称为pairSEQ。在这种方法中，T细胞随机分布于96孔板中，每个孔含有带有相同DNA barcode的一群细胞（图2a）。收集所有样本测序，将带有相同barcode的TCRα和TCRβ序列进行计算匹配并确认配对，由于TCR重排的高度多样性，出现带有相同barcode的两个克隆的可能性极低。这种基于频率的配对方法的缺点是只有扩增克隆可以被检测配对，所以不适合发现罕见TCRαβ序列。

图2. 单细胞TCR测序方法

单细胞TCR测序技术

单细胞分离技术的进步使获得配对TCRαβ链信息成为可能。早期的单细胞配对TCRαβ分析方法依赖于通过显微操作分离单个T细胞，再进行多重PCR和Sanger测序，然而这类方法耗时且效率和通量受限。目前，最普遍采用的分离单细胞方法是采用荧光激活细胞分选技术（FACS）。这种方法的优势是可以对感兴趣的细胞类群基于细胞表面分子标志物进行富集测序，而不用对样本中所有T细胞进行测序，这有助于分析罕见细胞亚群。这种方法可保证较高的测序质量和测序深度，从而产生更可信的TCR序列，这对于分析克隆多样性非常重要。在这种方法中，根据各种细胞表面不同蛋白结合不同荧光抗体并被单独分选至微滴孔板中，可以一次性分离数百个单细胞。然后，TCR链被逆转录并采用多重PCR法进行靶向扩增。研究者首次采用此方法分析抗原特异性CD8+ T细胞对于病毒感染的反应，并显示出较以往方法显著更高的双等位基因TCRα表达频率。对这种基于FACS的分离方法的改进包括通过使用基于PCR的barcode策略进行高通量测序。例如，在Han等描述的方法中，在巢式PCR扩增之后，通过引入PCR延伸步骤对每孔样本进行独特寡核苷酸标记（图2a）。这些barcode保留了转录本起源的信息，从而在保留TCRαβ链配对信息的同时可以进行不同样本混合的高通量测序。

另一种单细胞配对TCRαβ测序策略是基于细胞的乳化PCR方法。这类方法中，单细胞被捕获在油包水的乳化液滴中，其中含有TCR引物和RT-PCR试剂，经过OE-PCR（overlap extension RT-PCR）将TCRα和TCRβ转录本连接起来，然后融合的TCRαβ转录本进行富集、扩增和测序（图2b）。利用此乳化OE-PCR法，Munson等识别出存在于乳腺癌患者中的共享TCRαβ克隆，这说明共享抗原可引起抗肿瘤T细胞反应，而非患者特异的新抗原。

3. 利用单细胞TCR测序识别T细胞状态及功能

在单细胞水平上获取TCR序列信息是一大技术进步，进一步研究特定细胞状态下的TCR库能够提供更加全面的关于T细胞免疫反应的功能和生理信息。几个课题组开发出将TCR测序与其他组学方法进行整合的分析方法（图1b-d）。其中一类方法能够同时检测单个细胞的TCR和转录组，主要通过以下两种途径实现：（1）从单细胞测序（scRNA-seq）数据计算重构TCR链；（2）联合基因表达谱，特异性扩增TCR位点（图3）。

图3. 配对scRNA-seq和TCR测序方法概览

通过计算TCR重建将TCR与T细胞表型进行配对

从scRNA-seq数据提取TCR信息的计算方法通常依赖于结合比对和重头组装步骤来确认TCR来源的reads并重构TCR链（图3c和表2）。利用已知scRNA-seq方法进行TCR重构的一大挑战在于，依赖于扩增3’端转录本的方法不会捕获V（D）J所在的5’端。为了解决这个问题，研究者开发出利用全长cDNA扩增和测序的新方法，这种方法中，利用类似于5’RACE的模板转换机制来进行单个细胞的逆转录（图3b）。在片段化和测序后，单个TCR序列被计算重构并在其特定表型谱中进行分析。目前用于TCR重构的算法主要包括scTCRseq、TraCeR、VDJPuzzle以及TRAPeS（图3c）。

通过结合TCR序列和基因表达谱，这些计算方法提供了T细胞克隆表型动态的初步景观。一项研究采用TraCeR算法对来自鼠沙门氏菌感染的CD4+ T细胞的scRNA-seq进行分析，通过将重构TCR与其细胞转录组进行配对，作者追踪了在感染过程中，从激活到T辅助细胞，再到效应记忆T细胞状态的分化轨迹，这表明单个克隆可能经历多种不同的细胞命运。

尽管这些方法能够充分利用先前产出的scRNA-seq数据，然而成功重构TCR依赖于测序深度和TCR位点的表达水平，这在不同细胞中变异较大。所以，测序深度不够或者起始底物浓度太低都可能无法完全重构TCR库，并可能影响基于此的关于克隆性和多样性的生物学解释。

表2. 利用单细胞测序数据计算重建TCR的方法

通过同时进行RNA和靶向TCR测序将TCR与T细胞表型进行配对

为了获得更高覆盖度的TCR测序文库，几个课题组开发了将单细胞中RNA谱与靶向TCR双链扩增进行结合的方法（图3a）。其中一种方法采用多重PCR策略同时靶向TCRα和TCRβ链以及一个包含17个表型基因的panel，这些表型基因包括对于T细胞功能和亚型决定至关重要的细胞因子和转录因子。采用这种方法，研究者分析了结直肠癌的CD4+肿瘤浸润淋巴细胞特征并发现在FOXP3+RORC+和FOXP3-RORC+ T helper 17 (TH17) 细胞亚群之间存在共享克隆，这表明产生IL-17的细胞可来源于共同的祖先，这些祖先细胞在对抗原的反应进行扩增并分化出不同的表型。这些结果再一次印证了，在激活免疫反应过程中，CD4+ T细胞能够呈现出谱系可塑性。此外，这项研究表明FOXP3+ T细胞在肿瘤免疫中的复杂作用，尤其是与IL-17表达联合分析。

后续研究进一步扩展了将单细胞中RNA谱与靶向TCR双链扩增进行结合分析的通量。主要包括InDrop法（图3a，红线）、利用生物素标记的寡核苷酸探针比对到C区域的方法（图3a，紫线）（表1）以及RAGE-seq法（图3a，绿线），这些方法均采用捕获全长TCR测序，然而，由于nanopore测序的高错误率和多重测序需求，这些方法TCR回收率较低，并限制了广泛使用。

此外，采用5’ RNA扩增同时进行scRNA-seq和TCR测序的方法被开发出来。在这种方法中，与3’ 端scRNA-seq类似，细胞被包裹在含有barcode beads的液滴中，然而，与3’ 端scRNA-seq不同的是，barcode添加在与TSO相邻的cDNA 5’ 端（图3a，蓝线）。全长cDNA被富集并采用通用引物进行逆转录。将cDNA分为两部分，一部分用来进行TCR转录本靶向富集并比对至TCR恒定区，另一部分直接用于构建基因表达文库。这种5’ 端捕获方法被10x Genomics商业化并进一步加深了对于T细胞反应特性的理解，尤其在癌症研究中。Azizi等分析了人类乳腺癌肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）组成，以考察TCR库多样性与T细胞表型多样性的关系。整合细胞状态和TCR克隆型数据可揭示T细胞激活的连续轨迹，这可部分用TCR多样性来解释。此外，作者发现T细胞克隆主要集中于表型相关的细胞亚群，这些亚群表达相似的特征，比如失能和糖异生，这表明细胞状态很大程度上由TCR刺激和环境因素所决定。Yost等也利用此方法追踪抗PD-1治疗前后T细胞克隆动态，结果表明，治疗后扩增的CD8+ T细胞群主要包括此前未在肿瘤中的耗竭型克隆，这表明免疫检查点抑制剂通过招募新的T细胞克隆而非重新激活肿瘤中已经存在的耗竭型克隆发挥作用。

将TCR与表面蛋白进行配对

在单细胞水平同时分析TCR和转录谱能够提供高分辨率的T细胞状态信息。然而，利用蛋白表达进行T细胞表型分析可以更清晰的定义T细胞亚群，因为某些特定细胞类型的标志物在转录水平很难被检测到。此外，单细胞蛋白检测能够更好解决以下问题：（1）亚型使用，这对于识别表达PTPRC、CD45RO和CD45RA基因的效应和记忆T细胞群尤为重要；（2）细胞内蛋白活性和修饰，譬如关键T细胞转录因子的激活。为了解决上述问题，Mimitou等近期报道了一种称为ECCITE-seq的方法，该方法扩展了5’ 端scRNA-seq和TCR测序方法，以捕获细胞表面蛋白并同时检测基因表达和TCR库。该方法通过将与TSO互补的寡核苷酸耦连带有DNA-barcode的抗体来检测蛋白。ECCITE-seq可被扩展用于从CRISPR库中直接捕获single guide RNAs（sgRNA）并同时进行RNA、蛋白以及TCR测序。

将TCR与染色质可及性进行配对

联合单细胞TCR捕获和ATAC-seq分析特定细胞环境下的TCR序列，ATAC-seq是一种衡量基因组范围内染色质可及性的技术（图1c）。这种方法可以探索表观因子包括反式作用元件和顺式作用因子在驱动T细胞特异性和克隆扩增中的作用。例如，这种方法被用于识别之前采用标准FACS方法未能检测的淋巴瘤恶性T细胞克隆，并且有希望应用于提升目前鉴别良恶性T细胞增殖的诊断效力，为临床治疗提供表观组学靶点。

4. 将TCR序列映射到抗原特异性的策略

结合抗原特异性与T细胞克隆性以及表型检测对于理解T细胞反应的驱动因素至关重要（图1d）。T细胞抗原识别的几方面问题对将TCR序列映射至特异性构成了挑战，首先，抗原特异性T细胞频率极低，大约为百万分之一，检测这些细胞将极为困难；其次，由于MHC的多态性、TCR和pMHC的多特异性以及单个抗原编码的多个可能抗原表位，使得解析TCR抗原特异性变得异常复杂；最后，多数TCR-pMHC相关作用的亲和性较弱，这使得选择性分离抗原特异性T细胞群成为一项艰巨的工作。

已经有多种评价T细胞抗原特异性的方法，我们重点关注同时包含TCR测序的方法。其中一种研究抗原特异性T细胞的经典方法包括通过流式细胞术使用荧光标记的pMHC多聚物来分离识别特定MHC分子下特异性多肽的T细胞。然后，对抗原特异性T细胞群进行TCR测序或配对单细胞TCR和表型分析。这种方法通量较低，目前已经开发出能同时检测特异性数量的改进方法，主要通过添加DNA和磁性纳米颗粒barcode提高多聚TCR特异性检测，目前可同时检测1000以上的多肽特异性。然而这些方法只识别T细胞的抗原特异性，后来研究者又开发出同时捕获TCR的方法，这种方法可以刻画抗原特异性T细胞群的克隆性和TCR序列变异。TetTCR-seq就采用了这种方法，T细胞识别并结合带有DNA-barcode的pMHC四聚体从而被着色，然后采用FACS分选至单细胞孔（图4a）。随后同时对每个单个细胞的TCRαβ转录本和DNA barcode进行RT-PCR扩增，细胞barcode可用于在单细胞水平将TCR序列与其同源抗原进行配对。Zhang等采用此方法同时筛选出超过150中癌新抗原和野生型多肽对，这说明可以利用TetTCR-seq高通量识别具有功能活性的新抗原特异性TCR。

另一种同时检测抗原特异性和TCR序列的高通量方法采用了微流控技术。MATE-seq即为此类方法之一，这种方法使用磁珠纳米颗粒标记的pMHC四聚体，并连接光可切割的TCR特异性引物以在同一个液滴中同时捕获TCR序列和抗原（图4b）。具体来说，将T细胞与被纳米颗粒标记的pMHC文库进行孵育，并用磁珠进行分离纯化，将单细胞包裹在液滴中并裂解，纳米颗粒标记的pMHC暴露于UV中，从而释放靶向TCRαβ区域的RT-PCR引物。由于这些引物连接的一个DNA barcode对应相应的pMHC，在经历混合测序后，TCR序列和抗原特异性能够在单细胞水平被耦连起来。尽管这些改进极大提升了通量和将TCR序列映射到抗原特异性的分辨率，然而这些方法只适用于识别一个已知抗原特异性的相应T细胞，且需要对感兴趣的多肽预先设定。

图4.将TCR序列映射到抗原特异性的单细胞方法

5. TCR测序数据收集标准

高通量测序方法产生了海量TCR测序数据，随之而来的问题是如何标准化TCR测序数据以实现数据可重复性和共享。适应性免疫受体库委员会（AIRR）定义了关于适应性免疫受体库的最小信息标准（MiAIRR），这是一套报告抗体和TCR测序研究中元数据的指导方针，包括研究设计的细节、样本处理方法、数据处理过程、注释以及提交NCBI的规范。然而，仍然需要持续的努力来定义数据标准，且鼓励研究者遵循这些指导方针将有助于促进各个采用TCR测序技术的研究团体达成持续合作，以形成健康的学术生态。

展望

尽管TCR测序领域进展迅速，然而，更快、更灵敏、更低成本仍然是我们追求的目标，尤其对于单细胞方法。目前基于液滴的测序方法可达到约65%的单线态捕获率。这种低捕获率限制了研究结果的可解释性，因为在一次检测中被捕获的细胞可能无法代表最原始的细胞群体，特别是分析诸如外周血和其他免疫相关器官这种大样本细胞的情况。目前基于液滴的单细胞技术的另一个局限性是每次捕获最小投入量为近1000个细胞，这妨碍了分析罕见亚群，譬如抗原特异性T细胞群。此外，虽然微流控单细胞方法相比于传统基于孔板的方法成本显著降低，采用单细胞检测TCR库的成本仍然高于基于细胞群体的方法。新近出现的微孔检测技术可能为克服以上局限性提供了一种选择，这种微孔检测技术能够兼容较低的细胞投入量且比基于液滴的方法效率更高。除了以上技术改进，还可以通过结合不同技术的正交策略更细致地研究T细胞克隆性和生理功能。

最后，单细胞遗传谱系追踪的方法利用DNA barcode来标记细胞及其后代，这种方法在研究造血和其他大量生物学问题方面显示出巨大价值。将谱系追踪和TCR库结合起来能够帮助我们更细致地理解T细胞的发育轨迹和表型可塑性。然而这些方法在应用于生理环境，譬如人类组织之前需要多次迭代，每一次进步无疑会使我们更好地理解机体如何协调T细胞反应的机制，进而帮助我们开发更好的癌症、感染以及免疫相关疾病治疗策略。 END 

参考文献：

[1]  Pai JA, Satpathy AT. High-throughput and single-cell T cell receptor sequencing technologies. Nat Methods. 2021;18(8):881-892. doi:10.1038/s41592-021-01201-8

撰写丨 不一样的卡梅拉

编辑、排版丨SX