Plus深读 | m6A去甲基化酶FTO调控黑色素瘤发生，影响PD-1抗体治疗

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本研究分析了黑色素瘤中m⁶A去甲基化酶FTO调控肿瘤进展、以及影响PD-1抗体治疗效果。黑色素瘤患者以及小鼠模型中，FTO的水平明显上升；饥饿处理促进FTO的表达水平。FTO敲除后m⁶A甲基化增加，包括原癌基因PD-1、CXCR4、SOX10等，通过YTHDF2催化RNA降解。因此在黑色素瘤细胞系中敲低FTO能够增强其对于IFNg的敏感型，及其PD-1抗体治疗作用；并借此提出FTO抑制剂联合PD-1用药在黑色素瘤免疫治疗中的作用。

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FTO是黑色素瘤中的致癌因子

首先研究者发现FTO在黑色素瘤细胞表达远高于正常皮肤黑色素细胞（Fig 1a-b）；黑色素瘤细胞系中同样发现FTO水平升高（Fig 1c）。

在FTO高表达的黑色素瘤细胞系Mel624等敲低FTO（Fig 2a），能够抑制细胞增殖、生长、迁移和侵袭（Fig 2b-e）；同时FTO敲低的细胞在体内同样抑制肿瘤生长（Fig 2f-g）。

Figure 1

 

Figure 2

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黑色素瘤中FTO功能与m⁶A

FTO敲低后，细胞中mRNA的总体m⁶A水平上升（Fig 3a-d）。过表达m⁶A的催化酶METTL3/14同样能够提高m⁶A的水平（Fig 3e），也能抑制黑色素瘤细胞的增殖（Fig 3g），转移和侵袭（Fig 3h-i）。此外，FTO敲低对细胞的影响能够被METTL3/14敲低遏制

（Fig 3j-m），进一步说明FTO的生物学功能依赖于m⁶A。

Figure 3

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黑色素瘤中FTO下游基因的分析与寻找

通过转录组、m⁶A测序、芯片等综合分析（Fig 4a），FTO敲低影响PD-1的RNA水平，对PD-L1/CD47没有影响（Fig 4b）。此外分析发现FTO敲低后5‘和3’ UTR上m⁶A的水平提高（Fig 4c），并且改变m⁶A的定位（Fig 4d）；含有m⁶A修饰的基因数目有所增加（Fig 4e），但结合位点一致（Fig 4f）。并且FTO敲低抑制表达的基因，多表现为m⁶A水平上升（Fig 4g-h）。

Figure 4

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FTO关键性功能下游

以上的下游基因中，PD-1已知是重要的致癌基因；PD-1下游影响mTOR；此外CXCR4、SOX10等也都是黑色素瘤关键调节因子，都受到FTO的调节（Fig 5a-b）。在FTO敲低细胞中过表达PD-1，能够激活mTOR下游S6K的磷酸化水平（Fig 5c），并进一步影响细胞增殖（Fig 5d）和迁移（Fig 5e）。CXCR4和SOX10也具有同样的作用（Fig 5f-i）。此外，FTO敲低的同时继续敲低METTL3/14，则能够提高PD-1、CXCR4和SOX10的水平（Fig 5j-o），说明FTO对下游基因的控制依赖于m⁶A。

Figure 5

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YTHDF2在FTO功能中起到重要作用

已有报道发现，RNA的m⁶A修饰调节其表达依赖于m⁶A的reader，即YTH结构域的蛋白。FTO敲低不会影响m⁶A催化酶（MELL）和reader（YTHDF1-3）的水平（Fig 6a）。YTHDF1/3敲低都不会影响下游基因的mRNA水平，只有YTHDF2敲除后下游RNA增多（Fig 6b-d）。此外，FTO敲低导致下游mRNA的稳定性降低（Fig 6e-g），而YTHDF2敲低则增强mRNA的稳定性（Fig 6h-j），且促进肿瘤细胞体内和体外的生长和迁移（Fig 6k-l）。

Figure 6

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代谢压力/营养缺乏促进FTO表达

研究者进一步分析了黑色素瘤中FTO水平提高的原因，发现血清饥饿（FBS 0.2%）、和常规饥饿都能够促进其表达（Fig 7a-b），并伴随m⁶A水平下降（Fig 7c）。由于饥饿与自噬紧密相连，研究者分析了自噬关键性蛋白ATG5/7，发现其敲除会减少FTO对于饥饿的正响应（Fig 7d），以及其下游基因PD-1和NFkB通路（Fig 7e）。此外NFkB-p65敲低也能够抑制FTO和PD-1水平（Fig 7f-g），证明FTO和PD-1受到自噬和NFkB通路的影响。

Figure 7

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FTO在PD-1抗体阻滞中的作用

FTO促进黑色素瘤进展，在FTO高表达的B16F10细胞引起的肿瘤中，PD-1抗体不起作用（Fig 8a），而敲除FTO后则起到抗肿瘤作用（Fig 8a-b）。分析发现FTO敲低的肿瘤中PD-1抗体处理使得CD4+ T细胞浸润增加（Fig 8c），而CD8+ T细胞无差别；此外产生IFNg的CD4+和CD8+ T细胞浸润都没有变化（Fig 8d）。分析原因发现，IFNg刺激下FTO水平降低（Fig 8e），m⁶A水平升高（Fig 8f）；此外FTO水平降低促进IFNg刺激下的细胞死亡和生长受阻/升高则相反（Fig 8g-h）；同时FTO下游CXCR4、PD-1、SOX10等的过表达同样能够抑制IFNg导致的细胞死亡（Fig 8i-k）。IFNg抗体处理同样能促进体内肿瘤生长（Fig 8l）。

Figure 8

文章总结

本研究立足FTO，分析了分子功能，即去除mRNA的m⁶A修饰；生物学功能，即在黑色素瘤中的促癌作用。并且通过分子机理分析，发现抑制FTO导致全mRNA的m⁶A水平升高、以及关键性促癌基因PD-1、CXCR4、SOX10的m⁶A升高；高水平的m⁶A被reader-YTHDF2识别、并导致稳定性降低，从而降低下游基因的mRNA水平。通过调节这些下游基因水平，FTO调节黑色素瘤肿瘤进程。此外FTO水平的降低能够促进肿瘤对于PD-1抗体的敏感性，故联用有望达到更佳的治疗效果。在这个过程中INFg同样起到调节作用。

本文来自

Seungwon Yang. et al. m⁶A mRNA demethylase FTO regulates melanoma tumorigenicity and response to anti-PD-1 blockade. Nature Communications. (2019) 10:2782.

Reference

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