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本文原载于《国际呼吸杂志》2019年第3期 本文作者：沙俊 曹丹丹 韩淑华  在世界范围内，肺癌的发病率和病死率在恶性肿瘤中位居第一。但是在美国2018年癌症报告中显示[1]，由于控烟运动的全面开展，肺癌的发病率在美国癌症中降至第二，但是病死率仍居高不下，死亡人数在所有癌症死亡人数中占25%以上，其中小细胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)占肺癌总数的15%左右[2]。SCLC的早期诊断率较低，大部分患者确诊时已属于晚期，只有大约1/3的患者确诊时属于局限期，中位生存期为25个月，5年生存率为10%～20%；而大约2/3的患者确诊时就属于广泛期，中位生存期为14.5个月，5年生存率不到2%[3]。 大部分SCLC患者需要接受化疗，进行手术切除病灶达到根治的可能性低[4]。尽管SCLC患者早期对一线化疗方案敏感，但是极易复发，也极易发生多药耐药[5]，其耐药机制尚不明确，而可选择的二线治疗药物也较少。SCLC的早期诊断率较低，也极易出现早期转移，使得患者最初确诊SCLC时就已属于广泛期。就目前状况而言，缺乏对SCLC早期诊断敏感度高的检测手段，使得早诊断、早治疗难以实现。再者，SCLC患者经治疗病情达到完全缓解或部分缓解后，对患者预后长期随访目前只有影像学检查或者传统的肿瘤标志物，缺乏针对性的实验检测方法，影像学检查往往会忽视病情的微进展，常常在病情出现较大恶化后才被发现。 目前针对SCLC的早期诊断和连续监测疾病进展状况，检测患者外周血循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)是一项高效可行的方法，优于传统检测方法，未来的临床应用前景十分可观。本文就CTCs的发展历程、检测方法及其在SCLC患者诊疗中应用的新进展作如下综述。 1869年，澳大利亚籍医师Ashworth[6]在1例转移性癌症患者的外周血中首次发现了CTCs，为之后CTCs的临床应用奠定了物质基础。近年来，随着细胞分离和荧光标记技术的进步，CTCs检测技术也迎来巨大的提升，为CTCs的临床应用提供了技术支持。随着检测技术的逐步提升，对CTCs在肿瘤的早期诊断、疗效预测、预后评估等方面进行了深入探索，这也对检测技术的敏感性和特异性提出了更高的要求。因此，随着检测技术的不断进步，CTCs将逐步成为一种切实可行的肿瘤评估方法。 现如今，CTCs在其他肿瘤领域已经初露锋芒，具有很好的应用价值，如监测乳腺癌[7]、结肠癌[8]、前列腺癌[9]等，并对其疗效和疾病进展情况提供临床依据。 自CTCs被发现至今，研究者们长期致力于分离各种肿瘤的CTCs。然而由于其在外周血中含量极其稀少，又具有肿瘤异质性的细胞学特点，导致CTCs的检测具有极大困难。直到近年来，对CTCs有效的可重复性检测计数方法才被开发出来。 CTCs目前常用的检测方法主要有PCR技术、CellSearch半自动检验系统、免疫组织化学技术、FISH技术、细胞形态学分析、基于微流控芯片的CTCs捕获技术[10]，但各有利弊，大致上都可分为两大步骤：分离富集和检测鉴定[11]。分离富集通常是基于CTCs的形态特征或免疫学特征，主要包括密度梯度离心法、免疫磁性分选法、膜过滤上皮肿瘤细胞体积分离法等；检测鉴定技术主要分为细胞计数和核酸检测，主要技术有流式细胞计数、免疫细胞化学技术、CTCs芯片、RT-PCR技术等。近年来，有研究评估oHSV1-hTERT-GFP[12]CTCs检测方法在肺癌患者外周血中的临床应用价值，该方法的基本原理是利用CTCs端粒酶高启动活性，和溶瘤病毒(HSV-1)的嗜肿瘤特性相结合，将端粒酶启动子和GFP基因插入HSV-1，以该病毒为载体识别并感染CTCs，再通过CTCs端粒酶启动子特异启动基因表达GFP，最后用流式细胞仪检测和分选CTCs。结果显示，oHSV1-hTERT-GFP方法相较于目前临床最常用的CellSearch半自动检验系统检测率差异有统计学意义，检测敏感性更强，且不依赖于肺癌的病理类型、疾病分期，相较于CellSearch半自动检验系统需要7.5 ml外周血，oHSV1-hTERT-GFP方法需要的外周血更少，仅为4 ml。另外又有研究表明[13]，非催化内皮唾液酸酶在SCLC CTCs中高度表达，将基于非催化内皮唾液酸酶系统的捕获方式整合至CTCs捕获平台中，进一步提高SCLC CTCs的检出率。 3.1 CTCs与SCLC的早期诊断 影像学检查和常规病理组织检查是SCLC的传统诊断方式，然而SCLC患者一般在初次就诊时已经转移，而在已经发生转移的SCLC患者外周血中CTCs含量很高。目前肺癌的早期检查手段最常用的就是影像学检查、血清肿瘤标记物[14]和经皮穿刺活检[15]。由于血清肿瘤标记物缺乏特异性，低剂量CT假阳性率高而致不必要的侵入性检查，导致SCLC患者的早期诊断始终没有突破性进展。 恶性肿瘤都会通过血液传播转移到身体的其他组织和器官，而肿瘤转移是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤细胞侵入到肿瘤周围组织从而进入血液和淋巴系统，成为CTCs，并转运到其他组织、器官，形成新的转移灶。因此，早期发现外周循环中的CTCs对于恶性肿瘤患者早期诊断、预后、预测进展、指导治疗有重要意义。 就目前来看，早期肺癌患者的CTCs检出率并不高，而SCLC患者的CTCs检出率也较低[16]。但SCLC患者的CTCs具有一定的表型。有研究表明，利用神经内分泌肿瘤细胞表达的TTF-1和CD56[17]等已知的标记物可以提高CellSearch半自动检验系统无法检测到SCLC患者CTCs的机会，这种检测手段也更有利于对SCLC患者进一步的评估。所以，在进一步革新CTCs检出技术后，就能提高SCLC患者的CTCs检出率。目前CTCs的技术突破也正在研究之中，未来应用前景十分可观。 就目前而言，将检测CTCs应用于SCLC患者的早期诊断是可行且值得研究的。首先需要提高CTCs检测方法的敏感性和特异性，其次建立一套符合规范、统一的检测方法，虽任重道远但未来可期。 3.2 CTCs与SCLC的分期 恶性肿瘤的TNM国际分期已经有长达几十年的历史，在长期的临床工作中发现TNM分期有着自己的局限性，有些肿瘤在早期已经发生转移，单纯肿瘤体积以及浸润程度并不能完全反映恶性肿瘤的实际情况以及治疗的预后。尤其是SCLC，本身就以早期转移为特征，那么更早地发现并确诊SCLC，必会对治疗有着重大意义。 目前SCLC的分期主要以美国退伍军人肺癌协会分期系统和TNM分期为主。美国退伍军人肺癌协会分期将SCLC简要地分为局限期和广泛期。前者定义为病变局限于同侧半胸腔，能安全被单个照射野包括；后者定义为超过同侧半胸腔，包括恶性胸腔或心包积液或者血行转移。在2018年NCCN[18]指南中提出唯一适合手术的分期是T1-2N0M0，病理评估无纵隔淋巴结转移，推荐进行肺叶切除术、淋巴结清扫和取样。术后病理仍为N0进行术后辅助化疗，如术后病理为N＋同步化疗和纵隔放疗。而现实情况下，大多数SCLC患者在首次确诊时已经存在远处转移，这是绝大多数SCLC患者没有手术机会的主要原因，也给患者带来极其不好的预后。目前有许多细胞培养和小鼠肿瘤模型研究证实了上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)[19,20]在肿瘤进展中的重要作用。有研究表明[21]，对COPD患者进行前瞻性CTCs检测，结果发现其CTCs表型表达上皮和间充质标志物，这与相应的肺癌表型相似。目前SCLC转移扩散的机制尚不明确，也不能完全确定SCLC远处转移是否和EMT-间质表型上皮转化相关，这还需要相关的科学研究进一步探索其转移机制。但已有研究发现[22]，在将近90%的CTCs中，至少有1个EMT相关转录因子被上调，表明EMT-CTCs数量很多，一定程度上也可能说明CTCs的相关生理行为跟EMT密切相关。众所周知，晚期SCLC患者的CTCs含量非常高，容易在外周血中被检测到；而早期SCLC患者的CTCs含量就很少，难以被检测到。研究表明，CTCs与肿瘤分期有着密切的关系。Hiltermann等[23]进行了一项多中心试验，这项研究共入组SCLC患者59例，其中处于SCLC局限期21例，SCLC广泛期38例。检测结果显示，基线时SCLC局限期CTCs数目较广泛期少，而最初检测CTCs计数较多的患者生存期较CTCs计数少的患者明显缩短。目前尚缺乏大样本临床研究来确定CTCs计数对SCLC分期的具体指导意义。 3.3 CTCs与SCLC化疗耐药 SCLC是对化疗高度敏感的恶性肿瘤，初次化疗有效率高达80%左右，但是绝大部分患者在1年内均会复发，且复发后的耐药率相当高，使得SCLC患者复发后对化疗效果不理想[24]。学者们把经初始治疗后3个月内复发的SCLC定义为化学难治性SCLC，而3个月后复发的定义为化学敏感性SCLC。SCLC对化疗耐药的产生是SCLC难治、易复发的关键因素。目前，SCLC的全球化疗耐药机制尚未阐明。相关研究[25]为探究2种敏感性的遗传特性，分别检测了来自治疗前SCLC血液样品的CTCs中的基因拷贝数畸变(copy number alteration，CNA)，并在最初被指定为化学敏感性的患者复发后获得的CTC CNA特征显示其并未转变为化疗难治性的CTC CNA特征，这表明初始化疗抗性的遗传基础不同于获得的化疗抗性。有关研究表明[19]，SCLC的CTCs在外周血中易集中而形成肿瘤球体，此肿瘤球体具有核心部分缺氧和低生长分数的特征，其表型也和CTCs单细胞有显著的区别。研究中将CTCs单细胞悬浮液与肿瘤球体分别暴露于托泊替康和表柔比星，这2种化疗药通常被用于复发性SCLC的二线化疗，细胞毒性测定结果显示肿瘤球体表现出高细胞毒性，剂量反应曲线显示肿瘤球体对2种化疗药物的化学敏感性相较于CTCs单细胞悬浮液显著降低。 对于复发的SCLC，许多化疗药物无法改善治疗效果似乎和形成的肿瘤球体相关。肿瘤球体这种结构产生的结果是CTCs不加以选择地对各种化疗药物产生化学和物理抗性。研究发现[26]，将形成肿瘤球体的CTCs分离，分离后的CTCs对化疗的敏感性显著增加。由此看来，SCLC对化疗的普遍耐药，一定程度上可能不是细胞耐药机制，而是化学或者是物理抗性带来的耐药。而SCLC的CTCs自发聚集形成肿瘤球体的行为，可能由参与细胞聚集的蛋白质信号分子相互作用，阻断此信号通路很可能会对SCLC的治疗带来益处。 3.4 CTCs与SCLC疗效评价与预后 在SCLC患者的化疗过程中，通常使用实体瘤疗效评价标准评估患者病情，指导下一步治疗。在临床上常使用CT、PET-CT、磁共振成像等影像学手段来评估病情，具有一定程度上的滞后性，难以发现微小转移灶。由于SCLC的侵袭性特征，使其易发生早期转移，故主要的治疗手段仍是全身化疗，辅以局部放疗。 不过，近些年来，随着术后确诊SCLC的患者逐渐累积，有统计发现，SCLC患者手术切除后也有不短的生存期，尤其是处于T1、T2期且没有淋巴结转移的患者，手术预后更好。一项回顾性分析中[27]，将手术切除的SCLC患者和非手术治疗的SCLC患者进行倾向性匹配。研究结果发现，Ⅰ期SCLC患者接受手术治疗与非手术治疗相比有更长的生存期(中位总生存期分别为38.6个月和22.9个月，P<0.000 1)，但是在Ⅱ期(中位总生存期分别为23.4个月和20.7个月，P＝0.06)和ⅢA期(21.7个月和16.0个月，P<0.000 1)患者中，生存期差异减弱。总之，手术切除会显著提高早期SCLC患者的生存期。 近年来，多项研究表明，SCLC患者化疗前CTCs基线水平对治疗反应和预后有着显著的指导作用。Aggarwal等[28]进行了一项前瞻性研究，对新诊断的局限期和广泛期SCLC患者进行了连续CTCs筛查，共入组50例患者，其中局限期患者20例，广泛期患者30例。检测结果显示，局限期患者CTCs基线明显低于广泛期(1.5个/7.5 ml比91个/7.5 ml)，CTCs计数<5个/7.5 ml的患者与CTCs计数≥5个/7.5 ml的患者相比有较长的疾病无进展生存期(11个月比6.7个月，P＝0.025 9)，CTCs计数<50个/7.5 ml的患者与CTCs计数≥50个/7.5 ml的患者疾病无进展生存期(10个月比4.8个月，P<0.000 2)和总生存期(20.2个月比11.8个月，P<0.011 6)差异有统计学意义，化疗第2周期第1天CTCs计数<5个/7.5 ml的患者与CTCs计数≥5个/7.5 ml的患者相比疾病无进展生存期(10个月比3.17个月，P<0.001)和总生存期(18个月比9个月，P＝0.000 1)差异有统计学意义。Shen等[29]检测了80例SCLC患者CTCs，其中67例(83.8%)在基线时为阳性，结果显示CTCs水平相对较低的患者的无进展生存期(9.1个月比6.9个月，P＝0.045 8)和总生存期(11.1个月比8.6个月，P＝0.056)显著高于CTCs水平高的患者。也有其他研究结果显示，化疗1个周期后和2个周期后CTCs计数能提示治疗疗效及预后，CTCs计数相对较少的SCLC患者比CTCs计数相对较多的患者有更好的治疗效果和更长的无进展生存期及总生存期。总而言之，不管是SCLC患者在化疗前的CTCs基线计数，还是化疗后的CTCs计数，CTCs计数越少提示预后较好。 利益冲突 利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突 （参考文献略） |
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