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未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)是近来发现的细胞内重要应急机制。当内质网(ER)受到各种不利因素作用，ER正常的蛋白质折叠功能紊乱，大量的未折叠或者错误折叠的蛋白质在ER中聚集，通过ER膜上的蛋白质感受器激活相关信号通路，产生活性的转录因子调节各种基因的表达，以适应细胞环境变化或导致细胞凋亡。当哺乳动物细胞对UPR不适应时，就会导致JNK, CHOP, CASPASE12的激活，细胞凋亡则被启动。 哈佛大学和宾夕法尼亚大学的研究人员通过CRISPR KO文库筛选（靶向19,000个基因和1,800个miRNAs）ER应激诱导细胞凋亡的基因，发现ER应激诱导细胞凋亡的抑制因子L3MBTL2、MGA、miR-124-3，并揭示抑制ER应激诱导凋亡的机制。 图1 筛选流程 作者首先构建了CHOP-mCherry的报告细胞，通过As（砷）诱导ER应激，CHOP启动子被激活，mCherry报告基因在293T细胞中表达。接下来用CRISPR KO文库病毒以0.3 MOI感染CHOP-mCherry报告细胞，1ug/mL的嘌呤霉素药筛7天后，换为新鲜培养基。加入5uM的亚砷酸钠（As）处理15h，流式分选mCherry阳性细胞，重复2-3轮筛选获得的阳性细胞，提取DNA，进行sgRNA测序，下面是几个具有显著性富集sgRNA的基因，其中ASMT、SLC52A1、MB21D2、L3MBTL2有3-4种sgRNA富集。研究者分别构建单基因敲除细胞株，As处理后流式分选，结果显示在应激状态，只有L3MBTL2 KO细胞产生强烈的mCherry荧光蛋白。因此，研究者决定进一步研究L3MBTL2在细胞应激中的作用。 图2 生信分析 L3MBTL2 KO细胞株无论在As诱导的应激还是无应激状态，mCherry、CHOP表达量显著增强，其中As诱导组L3MBTL2 KO细胞凋亡率显著升高，结果提示L3MBTL2可能是ER应激诱导细胞凋亡的抑制因子。 图3 Loss of L3MBTL2 increases CHOP expression and sensitizes cells to ER stress-induced apoptosis. 研究结果表明：无内质网应激状态下，L3MBTL2与CHOP启动子的CEBP/ATF结合，抑制CHOP的转录表达；在As、Tg、Tm、Sal003等不同条件诱导的ER应激状态下，L3MBTL2与CHOP解离，CHOP表达增强，从而促进细胞凋亡。 图4 L3MBTL2 associates with the CHOP promoter to repress its induction 抑制或敲除MiR-124-3，As诱导ER应激，mCherry、CHOP表达量显著增强，其中As诱导MiR-124 KO细胞凋亡率显著升高，结果提示MiR-124在ER应激诱导细胞凋亡中扮演者重要作用。 图5 MiR-124-3 inhibits ER stress-induced CHOP expression and its knockout augments ER stress-induced apoptosis. MiR-124-3显著下调IRE1α/ERN1、XBP1s；机制验证结果表明，MiR-124-3靶向结合ENR1，从而抑制ENR1的转录表达。 图6 MiR-124-3 directly targets IRE1. ER应答失调是多种疾病的发病机制，然而细胞如何抑制过激的ER应答以避免细胞凋亡、维持稳态仍然未知。本文通过CRISPR筛选文库，揭示了多个ER应激的抑制因子，L3MBTL2直接抑制ER应激诱导细胞死亡转录因子CHOP的表达；MiR-124-3靶向结合到IRE1，从而抑制ER应激诱导细胞凋亡的发生。研究结果揭示了ER应激反应过度相关的疾病的发病机制，为哪些与过度内质网应激的病人提供潜在的治疗靶点。 |
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