【临床研究】自身免疫性小脑炎相关抗神经抗体的筛查与临床意义

文章来源：中华神经科杂志,2019,52(4): 304-309

作者：任海涛 徐晓璐 关鸿志 范思远 钱敏 杨洵哲 李力波 马明圣 邸卫英 张炜华 Fechner Kai 彭斌 崔丽英     

摘要

目的

在病因未明的小脑性共济失调患者中筛查自身免疫性小脑炎（autoimmune cerebellitis，AC）相关抗体并探讨其临床意义。

方法

收集病因未明的小脑性共济失调患者（来自2016—2018年北京协和医院神经科门诊和住院患者、北京脑炎协作组成员单位提供的病例）的血清和（或）脑脊液，进行AC相关抗神经抗体检测。采用德国欧蒙公司的间接免疫荧光试剂盒、间接免疫荧光转染细胞（基于细胞底物的实验）法和猴小脑组织（基于组织底物的实验）多抗原共片生物马赛克。所检测的AC抗体谱包括抗谷氨酸脱羧酶65（glutamic acid decarboxylase 65，GAD65）、锌指蛋白4（zinc finger protein 4，ZIC4）、Tr[delta/notch样表皮生长因子相关受体（delta/notch-like epidermal growth factor-related receptor，DNER）]、三磷酸肌醇受体1（inositol 1，4，5-trisphosphate receptor 1，ITPR1）、Homer同源蛋白3（homer protein homolog 3，Homer-3）、神经软骨素（neurochondrin，NCDN）、碳酸酐酶相关蛋白Ⅷ（carbonic anhydrase-related protein Ⅷ，CARP Ⅷ）和浦肯野细胞2型（Purkinje cell antibody 2，PCA2）抗体。

结果

全部400例患者中共8例患者通过该AC抗体谱检测到抗神经抗体（检出比例2%），其中包括抗GAD65抗体阳性2例，抗Tr（DNER）抗体阳性2例，抗PCA-2抗体阳性1例，抗Homer-3抗体阳性1例，抗NCDN抗体阳性2例。8例患者均临床主要表现为小脑性共济失调，部分患者合并边缘性脑炎，1例抗GAD65抗体阳性患者合并小细胞肺癌，8例患者接受免疫治疗，4例患者部分有效。

结论

自身免疫性小脑共济失调是获得性小脑性共济失调的病因之一，AC抗体谱的检测有助于该病的诊断。新AC抗体谱阳性患者多数为非副肿瘤性AC，部分病例免疫治疗有一定效果。

自身免疫性小脑炎（autoimmune cerebellitis，AC）又称自身免疫性小脑共济失调（autoimmune cerebellar ataxia，ACA）是获得性小脑性共济失调的病因之一，与AC有关的抗神经抗体检测对该病具有确诊意义。与遗传小脑性共济失调相比，AC具有相对的可治性，但由于其相对少见，临床上缺少实用的抗神经抗体检测方法，因此国内报道甚少。与经典的副肿瘤性小脑性共济失调对应抗Hu、Yo、amphiphysin等抗体相比，自身免疫性小脑共济失调涵盖的相关抗体更为多样。2015年德国海德堡大学的Jarius和Wildemann^[1,2,3]教授在Journal of Neuroinflammation杂志发表了名为'美杜莎共济失调'（Medusa-head ataxia）的综述，详细阐述了AC及其相关抗体。这组抗体多数在间接免疫荧光实验中与小脑浦肯野细胞的胞质和树突结合，因呈现形状如女巫美杜莎的'海蛇头'而得名。为筛查AC患者，我们制定了包括8种新抗体的AC抗体谱检测方案，将抗谷氨酸脱羧酶65（glutamic acid decarboxylase 65，GAD65）、锌指蛋白4（zinc finger protein 4，ZIC4）、Tr[delta/notch样表皮生长因子相关受体（delta/notch-like epidermal growth factor-related receptor，DNER）]、三磷酸肌醇受体1（inositol 1，4，5-trisphosphate receptor 1，ITPR1）、Homer同源蛋白3（homer protein homolog 3，Homer-3）、神经软骨素（neurochondrin，NCDN）、碳酸酐酶相关蛋白Ⅷ（Carbonic anhydrase-related protein Ⅷ，CARP Ⅷ）和浦肯野细胞2型（purkinje cell antibody 2，PCA2）抗体等作为AC组套检测，采用间接免疫荧光转染细胞[基于细胞底物的实验（cell based assay，CBA）]基质和猴小脑组织[基于组织底物的实验（tissue based assay，TBA）]基质多抗原生物马赛克，对病因未明的小脑性共济失调患者进行AC抗体筛查，现总结如下。

资料和方法

一、研究对象

本研究为封闭式筛查试验，血清和脑脊液样本来自2016—2018年北京协和医院神经科门诊、住院患者以及北京脑炎协作组成员单位提供的病因未明的小脑性共济失调病例。所有入组病例均需提供完整的临床资料，并初步排除遗传、代谢及药物相关等病因。通过北京协和医院神经科脑炎与副肿瘤综合征登记系统，建立临床资料与样本登记流程，筛查流程为自身免疫性脑炎抗体谱[包括抗N-甲基-D-天冬氨酸受体（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）抗体、抗富亮氨酸胶质瘤失活蛋白1（leucine-rich glioma inactivated-1，LGI1）抗体、抗γ-氨基丁酸B型受体（gamma-aminobutyric acid B receptor，GABA_BR）抗体、抗接触蛋白相关蛋白2（contactin-associated protein like 2，CASPR2）、抗α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体1（α-amino- 3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor 1，AMPAR1）抗体、抗α氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体2（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic acid receptor 2，AMPAR2）抗体、抗二肽基肽酶样蛋白（dipeptidyl-pepti dase-like protein-6，DPPX）抗体）]和副肿瘤抗体谱（抗Hu、Yo、Ri、Cv2、Ma2、amphiphysin抗体）及炎性脱髓鞘性疾病相关抗体[抗水通道蛋白4（aquaporin-4，AQP4）抗体、抗髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（myelin oligodendrocyte glycoprotein，MOG）抗体]均为阴性，根据患者临床表现为小脑性共济失调入组筛查。对该AC抗体谱阳性患者进行临床评估、免疫治疗与随诊。临床评估与登记根据北京协和医院《脑炎与副肿瘤神经综合征登记项目》（项目由北京协和医院医学伦理委员会批准，项目编号JS-891），所有患者均签署了知情同意书，同意其临床资料与标本用于临床研究。

二、AC抗体谱检测

AC新抗体谱方案由北京协和医院神经科实验室与德国欧蒙医学实验免疫学实验室（EUROIMMUN Lübeck Medical Laboratory）合作制定，包括GAD65、Tr（DNER）、ZIC4、ITPR1、Homer-3、NCDN、PCA2、CARP在内的转染细胞（CBA）基质和猴小脑组织（TBA）基质多抗原生物马赛克，采用间接免疫荧光法。检测步骤：滴加待测血清或血浆（1∶10磷酸缓冲液稀释）、脑脊液（原液）各30 μl至加样板的反应区，然后将载片有生物薄片的一面朝下，与加样板相对应的凹槽紧密对合，反应即刻开始，室温温育30 min，磷酸缓冲液冲洗，滴加25 μl异硫氰酸荧光素标记的羊抗人IgG在室温温育30 min，磷酸缓冲液冲洗，置于荧光显微镜下观察。

结果判读：转染细胞荧光形态与阳性对照一致，滴度的判读根据阳性细胞的比例和荧光的强弱进行判断观察，组织学（TBA）法观察猴小脑颗粒层、分子层以及浦肯野细胞的胞质、胞核、树突等形态结构的特异荧光模型。

三、治疗及评估

对抗体阳性的小脑性共济失调患者，采用激素和（或）静脉免疫球蛋白治疗，部分患者接受吗替麦考酚酯（mycophenolatemofetil，MMF）的长程免疫治疗。具体免疫治疗方案参考中华医学会神经病学分会的《中国自身免疫性脑炎诊治专家共识》^[4]，以及自身免疫性脑炎MMF诱导期与维持期方案^[5]。治疗前、后均采用改良的Rankin量表（modified Rankin Scale，mRS）对患者的神经功能状态进行评估。

图1 采用间接免疫荧光法的自身免疫性小脑炎抗体谱检测。A：抗谷氨酸脱羧酶65（GAD65）抗体阳性，猴小脑小脑颗粒层和分子层产生细颗粒样的胞质荧光模式，细胞核阴性；采用基于组织底物的实验（TBA）法×200；B：抗GAD65抗体阳性；采用基于细胞底物的实验（CBA）法×200；C：抗Tr[delta/notch样表皮生长因子相关受体（DNER）]抗体阳性，猴小脑浦肯野细胞的胞质呈粗颗粒样的荧光，分子层表达为细颗粒、细沙状的荧光，并延展到树突结构；采用TBA法×200；D：抗Tr（DNER）抗体阳性，采用CBA法×200；E：抗浦肯野细胞2型抗体阳性，猴小脑浦肯野细胞胞质的颗粒状荧光，采用TBA法×200；F：抗Homer同源蛋白3抗体阳性，采用CBA法×200；G：抗神经软骨素（NCDN）抗体阳性，猴小脑颗粒细胞层和分子层浦肯野细胞胞质呈细颗粒状的荧光；采用TBA法×200；H：抗NCDN抗体阳性；采用CBA法×200

二、临床资料

8例患者均表现为急性或亚急性起病的小脑性共济失调，且均具有下肢共济失调、行走不稳的表现；伴有眩晕5例，上肢共济失调者5例，构音障碍者5例。伴有近记忆减退者、精神行为异常者2例，其他临床表现未见异常。发现恶性肿瘤者1例：例7抗GAD65抗体阳性合并小细胞肺癌（表1）。辅助检查：脑脊液检查白细胞升高者2例，脑脊液细胞学4例提示淋巴细胞性炎症，脑脊液特异性寡克隆区带阳性者4例。8例均行头颅MRI检查，提示小脑萎缩者3例，5例未见明显异常（表2）。8例患者接受免疫治疗，包括糖皮质激素（7例），静脉注射免疫球蛋白（5例）、MMF（3例），4例患者部分有效（表3）。

讨论

我们采用了包括8种新抗体的AC相关抗体组合对病因未明的小脑性共济失调患者进行筛查，共入组400例患者，总的AC抗体谱阳性病例比例为2%（8/400），这提示AC是小脑性共济失调的少见病因。目前国际上关于AC研究多为针对单一抗体或合并其他副肿瘤相关抗体的研究，尚无类似AC抗体谱筛查结果。但考虑到该AC抗体组合涵盖有限，而且AC的相关抗体还在被逐步发现和报道，因此2%并不能代表AC实际的患病比例。而且，相对小脑性共济失调的常见病因——遗传变性，AC具有一定的病因可治性，因此在病因未明的小脑性共济失调患者中进行抗体筛查，及时诊断其中AC病例具有必要性。

本组抗体阳性AC病例以非副肿瘤性为主，仅有1例抗GAD65抗体阳性患者合并小细胞肺癌。本研究入组的病例排除了抗Hu、Yo、Ri和Amphiphysin、Ma2、Cv2抗体阳性的患者，抗Hu、Yo与Ri抗体属于经典的副肿瘤神经综合征相关抗体，特别是抗Yo抗体^[6,7,8]与抗Hu抗体^[9,10,11]与副肿瘤性小脑性共济失调相关。而我们采用的AC抗体组合主要为新近发现或者处于临床转化阶段的非副肿瘤性抗神经抗体。在我们以往的研究中，也发现少部分抗Yo^[12]或者Amphiphysin^[13]阳性患者经全面的肿瘤排查和长期随访未见肿瘤，可以最终临床诊断为非副肿瘤性AC。

本组筛查的8种AC相关抗体中，5种抗体发现了阳性病例，3种抗体未发现阳性病例，提示某些抗体的发生率极低；因此相对于单一AC抗体检测，AC抗体组合检测或者谱系检测更适用于临床筛查。本研究中阳性病例包括抗GAD65抗体、抗Tr（DNER）抗体、抗PCA-2抗体、抗Homer-3抗体与抗NCDN抗体，抗体阳性病例在临床表型上与以往的研究报道基本一致。抗GAD65抗体与自身免疫性边缘性脑炎、僵人综合征及AC相关，因此在AC以外的神经免疫综合征中也可以检出，多数患者无恶性肿瘤^{[14,15,16,17]}，抗Tr抗体主要针对存在于神经元胞质以及浦肯野细胞胞质及树突中的DNER蛋白，以AC为主要表现，部分患者合并淋巴瘤^[18,19,20]。抗Homer-3抗体阳性病例主要表现为小脑性共济失调，可以有脑炎的其他症状，少数患者合并肺癌^[21,22]。NCDN是表达于神经元的胞质、胞体及树突中的相对分子质量为75 000的蛋白，与G-蛋白偶联受体存在相互作用，抗NCDN抗体阳性病例主要表现为亚急性或慢性进展的小脑性共济失调等^[23]。抗PCA2抗体的具体靶抗原尚未明确，因此该抗体确认主要依靠TBA特异性荧光形式。

TBA在神经系统自身免疫性疾病的实验室诊断中应用较广。组织法以往主要作为一种初筛方法，用于对疑似患者的筛查，但其特异性依赖于检测者的经验。对于AC相关抗体的检测，TBA的读片与结果判读具有一定挑战性。'美杜莎共济失调'的组织荧光形式的抗体有10余种，各种荧光形式之间有时很难完全区分，有时需要结合其他组织的荧光形式进行判断，例如借助鼠肾、鼠肠道组织。另外组织中存在各种非神经特异性的抗原成分，可能与血清和脑脊液中同时存在样本中的其他自身抗体结合，影响免疫荧光的结果判读。例如健康人也可以存在抗核抗体，或者患者合并的其他自身免疫性疾病而伴有抗其他组织的自身抗体，这些抗体都可能影响免疫荧光形式，干扰结果的判读。在我们采用了TBA与CBA联合检测，这样有助于两种方法的相互比对确认，也可检测因CBA的抗体组合有限而导致的漏诊。

作为一个初步的筛查研究，本研究存在诸多局限性。例如作为筛查的入组标准，病因未明的小脑性共济失调病例在入组时虽然初步排除了遗传、代谢及药物相关等病因，但某些阴性病例在后期的随诊中可能确诊为遗传性小脑共济失调和多系统萎缩等，但这并不影响AC相关抗体作为筛查实验的临床指征。另外，本组病例总体的免疫治疗与随诊周期较短，尚无法就其长期预后、预后相关因素与免疫治疗方案等提供数据与建议，这些都需要通过进一步的随诊评估获得；同时，关于自身免疫性小脑炎的免疫治疗，尚无统一的共识与建议。

总之，AC是获得性小脑性共济失调的病因之一。AC相关抗体多为罕见的抗神经抗体，由于尚不明确这些抗体是否存在鞘内合成，目前建议采用血清和脑脊液配对检测，TBA与CBA联合的AC抗体谱系检测方法具有可行性。新AC抗体谱系阳性病例多数为非副肿瘤性AC，部分患者免疫治疗有一定效果。