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IF：9.58 发表日期: 2016.11.15 摘要：尽管在多种癌症中，PD-1阻断剂的临床反应率令人印象深刻，但大多数患者仍然对这种治疗没有反应。小鼠CT26肿瘤表现出相似的异质性，大多数肿瘤不受PD -1抗体的影响。与人类一样，CT26对PD -1阻断剂的反应与T细胞和B细胞浸润及IFN表达的增加有关。我们发现，在PD -1阻断剂无应答者中，瘤内注射高剂量TLR9激动剂SD-101可诱导所有注射部位肿瘤和大多数未注射的远处肿瘤的完全、持久的消退。 在TSA乳腺腺癌和MCA38结肠癌模型中同样观察到联合治疗（PD-1+SD-101）的效果，而单用PD-1效果不佳。瘤内注射SD-101大幅度地增加了白细胞的浸润和IFN调控相关基因的表达，并且其活性依赖于CD8+ T细胞和I型IFN信号通路。PD-1阻断剂联合瘤内注射SD-101增加了活化的增殖性CD8+ T细胞浸润，诱导了总的以及肿瘤抗原特异性CD8+ T细胞的增加并分泌IFN-γ 和 TNF-α。此外，PD-1阻断可改变CPG介导的肿瘤特异性CD8+ T细胞分化为CD127lowKLRG1high短期效应细胞，优先扩增 CD127highKLRG1low长期记忆前体细胞。联合治疗所产生的肿瘤控制和T细胞浸润与次级淋巴器官的T细胞转运是独立的。这些发现表明瘤内注射CPG寡核苷酸可能可以增加患者对PD-1阻断剂的反应性，提高CD8+ T细胞的数量和质量。 Fig. 1. Mice bearing CT26 tumor nodules produce a heterogeneous response to systemic PD-1 blockade. CT26荷瘤小鼠对PD-1阻滞剂的反应存在异质性（差异性） 首先，作者团队进行了CT26荷瘤小鼠对PD-1反应的验证，荷瘤模型为：CT26细胞于第0天在双侧均皮下注射，抗PD-1在第5、8、11、14和18天进行腹腔注射。发现CT26荷瘤小鼠对PD-1阻滞剂的反应始终存在差异，至5剂抗PD -1治疗结束，60个肿瘤中有26个出现完全(17%)或部分反应(26%)(即肿瘤体积减少超过80%)（图A），余肿瘤表现出无反应性;与无反应或未经治疗的肿瘤相比，抗PD -1应答者肿瘤中浸润性白细胞TIL密度增加（图B）;最后一次抗PD-1治疗4天后取出肿瘤，进行TAQMAN基因表达分析，抗PD -1治疗后肿瘤的减小与 ①I型IFNs调控基因的表达升高；②T细胞的存在和活化；③免疫球蛋白(IgH-6)和B细胞特征基因(包括B细胞趋化因子CXCL13)相关（图C）；在未治疗鼠（Day7直径为2–4 mm）中，也发现I-IFN、T、B细胞基因表达同样存在异质性（图D），但PD-1治疗有反应的肿瘤中相关基因表达上调；通过使用I型IFN受体的阻断抗体，可以消除PD-1阻断的阳性反应（图E）；  Fig. 2. Intratumoral SD-101 reverses tumor escape from anti–PD-1 therapy and leads to CD8+ T-cell and IFNAR-mediated tumor rejection. 瘤内注射SD-101可以逆转肿瘤逃避抗PD -1治疗，引起CD8+ T细胞和IFNAR介导的肿瘤排斥反应  为了评估SD-101治疗是否能将抗PD -1无应答者转化为应答者，小鼠在开始抗PD-1治疗后12 d随机分为两组，分别注射SD-101或非活性非CPG寡核苷酸(CTRL-ODN)，同时继续抗PD -1治疗(图A、B);同理使用PD-L1抗体也有相同的效果(图C、D)；CT26双侧成瘤鼠，治疗侧给药，未治疗侧肿瘤也缩小了，并诱导长期生存效应--13/19 (68%)(图E)；这一效应需要CD8+而不需要CD4+ T细胞，因为只有CD8+T细胞缺失的小鼠才会出现治疗效果的丧失（在第一次SD-101治疗前一天敲除CD8）(图F)；SD-101刺激了抗PD -1无反应的小鼠IFNs和IFN调节基因水平，使其表达水平与抗PD -1有反应性的肿瘤相当(图G)；阻断IFN信号降低了对抗PD -1 联合SD-101的抗肿瘤反应(图H)。 至此，作者团队得出结论：瘤内注射CPG这一免疫调节剂，逆转PD-1耐药，产生了抗肿瘤反应；但是在其他肿瘤中是否也有相同的而效果呢？作者团队在PD-1治疗效果更差的MCA38、TSA乳腺腺癌模型中也进行了验证，发现同样有效果； Fig. 3. SD-101 in combination with anti–PD-1 significantly improves the survival of mice bearing MCA38 colon carcinoma SD-101 联合抗PD-1治疗大大提高了MCA38结肠癌荷瘤小鼠的生存率  即换两个移植瘤模型也有同样的抗肿瘤效应；在MCA38、TSA中，其PD -1阻滞剂诱导肿瘤排斥反应的能力有限，较CT26更弱；SD-101在抗PD -1治疗的双侧成瘤的小鼠一个肿瘤部位注射，在注射和未注射的肿瘤部位均有明显的肿瘤排斥反应(图A-D)；瘤内注射SD-101可以通过增加IFN的产生和促进CD8+ T细胞反应来清除治疗和远处治疗的肿瘤，从而开启PD-1/PD-L1阻断的治疗潜力； Fig. 4. Microarray analysis of tumors treated by anti–PD-1, SD-101, or the combination of anti–PD-1 and SD-101. 单用PD-1/SD-101或联合治疗后肿瘤的微阵列分析  为了确定抗PD-1联合SD-101反应相关的功能通路，作者团队对每个治疗组中2 - 3个CT26肿瘤的3 - 4个复制池进行了微阵列分析(图A、B)；抗PD -1治疗无应答者和CTRL-ODN治疗肿瘤的基因表达谱无明显差异。治疗组肿瘤中差异表达基因(DEG)与对照组肿瘤中差异表达基因(DEG)重叠的韦恩图(图C);每个治疗组中，有将近30%的差异表达基因都是由I或II型 IFN通路调控的(图D)；采用先进的基因本体论(GO)分析方法，来认识这些基因表达变化所代表的生物学过程(图E)； 结论：SD-101联合PD-1阻滞剂治疗，免疫相关基因上调。 Fig. 5. SD-101 in combination with anti–PD-1 induces accumulation of polyfunctional T cell with increased clonality. SD-101联合PD-1阻滞剂治疗诱导多功能性T细胞克隆、聚集  作者团队从接受PD-1阻滞剂 + 3个疗程SD-101或CTRL-ODN的肿瘤中分离出TILs(图A);在最后一次治疗后的第4天收集肿瘤，与使用CTRL-ODN治疗的肿瘤相比，此时对治疗有反应的小鼠肿瘤体积减小,但仍然相似，相应的T细胞功能状态也相似(图B);单用PD-1或SD-101显著增加CD3+CD8+ T细胞密度(每克肿瘤 细胞数)，也可增加CD8+ T细胞在TILs中的比例,联合治疗显著增加CD3+ CD8+ T细胞数量、比例(图C)。相对于PD-1无反应性肿瘤，在所有三个有反应的治疗组中，CD45+细胞中CD3+CD4+ T细胞的比例都有所下降(图D)。这一下降并不是因为CD4+ T细胞中Treg (CD4+FOXP3+)的比例下降，而在所有治疗组中Treg的比例都是相同的(图E)；治疗组中，有增殖活性的Ki-67+ CD4+和CD8+ T细胞显著增加(图F)；同时，表达IFN-γ和TNF-α的CD8+ T细胞的比例和CD4 + T细胞也增加了(图G)；联合组中通过AH1-MHC多聚体的特异性针对肿瘤抗原CT26、gp70的CD8+ T细胞也增多了，而且AH1+ IFN-γ and TNF-α细胞也显著增多(图H、I)； 说明：联合治疗促进了CD8+ T细胞的募集，其中许多细胞是针对肿瘤抗原的，它们增殖并表现出多种功能，并能逆转TIL耗尽表型。 单独抗pd -1或联合治疗的肿瘤中，具有MPEC表型的抗原特异性CD8+ T细胞数量显著增加，而单独治疗的SD-101组中，具有的CD8+ T细胞高度富集SLEC表型，并且与抗pd -1无应答组相比，单纯应用SD-101和抗pd -1联合应用SD-101治疗肿瘤的T细胞克隆性指数显著增加(图J、K)；使用后鞘氨醇1-磷酸受体-1拮抗剂 FTY720，说明T细胞是瘤内活化的，而不是二级淋巴结转移过来的（图M）。 About us： 格源致善是一家以个性化肿瘤疫苗的研究和应用为核心的生物医学科研公司，始终聚焦于个性化肿瘤疫苗的临床治疗研究、新抗原预测和标准化评估体系的建立。 |
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