​PNAS | 拟南芥PATRONUS蛋白是分离酶抑制剂！新研究揭示细胞分裂过程染色体分离的调控机制...

真核生物的细胞周期包含间期和分裂期两个阶段，细胞分裂又分为有丝分裂和减数分裂，其核心事件都是染色体的分离。有丝分裂中姐妹染色体的分离需满足两个条件：第一，连接姊妹染色单体的黏连蛋白降解；第二，姐妹染色单体在纺锤丝的牵引下分别移向细胞的两极。减数分裂过程染色体的分离行为更加复杂，减数分裂包含一次染色质复制，两次细胞分裂。在减数分裂I，染色体臂上的黏连蛋白降解，着丝粒附近的黏连蛋白仍然保留，导致同源染色体分离，姊妹染色单体仍然相互黏连；减数分裂II，着丝粒附近的黏连蛋白降解导致姐妹染色单体的分离【1】。黏连蛋白的降解由分离酶催化【2】，为了保证黏连蛋白在恰当的时期降解，分离酶的活性被严格的调控。在真菌和动物中分离酶的催化活性可被分离酶抑制剂所抑制，分离酶抑制剂作为分离酶的假底物与分离酶结合后阻止了分离酶与黏连蛋白的结合【3】。在细胞分裂后期刚开始的时，分离酶抑制剂被后期促进复合物介导的泛素化修饰途径所降解【4】。分离酶在真菌，动物和植物中都被报道，功能类似，而分离酶抑制剂只在真菌和动物中发现，植物中一直没有发现分离酶抑制剂，这一度让研究者怀疑植物中是否存在通过分离酶抑制剂调控分离酶活性的机制。

近日，来自法国巴黎-萨克雷大学的Raphael Mercier教授团队通过遗传学，生物化学等手段揭示了拟南芥PATRONUS蛋白就是分离酶抑制剂，填补了植物分离酶抑制剂研究的空白。相关结果以Patronus is the elusive plant securin, preventing chromosome separation by antagonizing separase为题发表于杂志PNAS上。

拟南芥的PATRONUS蛋白由两个同源基因所编码，PANS1 和 PANS2。前期研究已发现在pans1突变体中，姐妹染色单体间的黏连蛋白提前降解，导致减数分裂II过程染色体错误分离【5】。但是PANS1调控黏连蛋白降解的机制一直不清楚。pans2 单突没有表型，但是与pans1双突后致死。PANS1在N端含有D-box和KEN-box两个结构域，通过这两个结构域PANS1与后期促进复合物结合，然后经过泛素化途径降解。研究者将PANS1的D-box突变后回补到pnas1中构建PANS1ΔD株系，PANS1ΔD产生了与pnas1完全相反的表型，包括黏连蛋白无法降解，减数分裂中期I拉长，染色体二价体及姐妹单体无法分离等。这些结果进一步证实了PANS1对于黏连蛋白的保护作用。

 图1：Immunolocalization of the cohesion REC8 was performed on meiotic chromosome spreads stained with DAPI.

为了探索PANS1保护黏连蛋白的内在机制，研究者进行了pnas1抑制子的筛选。研究者发现分离酶AtESP基因的突变可以恢复pnas1的表型，证明PANS1和分离酶以相互拮抗的方式调控黏连蛋白的降解。并且PANS1ΔD的表型与esp突变体表型类似，暗示着当D-box突变后，PANS1不能被后期促进复合物介导的泛素化途径降解，PANS1大量积累抑制了分离酶的活性，使得黏连蛋白不能降解。研究者又通过pull down，Y2H和BiFC 证明了PANS1在体内和体外均可以和分离酶相互作用，进一步证明了上述推测。最后研究者通过序列比对分析发现虽然植物的PANS和真菌及动物的分离酶抑制剂序列相似度比较低，但它们都存在三个保守的结构域：N端的D-box和KEN-box结构域，这两个结构域介导PANS与后期促进复合物的结合，以及中部区域的一个含有保守的谷氨酸残基的结构域，这个结构域对于抑制分离酶活性是必须的。

图2：Mutations in SEPARASE suppress pans1.

综上所述，该研究证实了PATRONUS是植物的分离酶抑制剂，通过抑制分离酶活性来保护黏连蛋白。进一步明确了植物细胞分裂过程染色体分离的调控机制。

参考文献

【1】MERCIER, R., MEZARD, C., JENCZEWSKI, E., MACAISNE, N. & GRELON, M. The molecular biology of meiosis in plants. Annu Rev Plant Biol, 66, 297-327(2015).

【2】J. Kamenz, S. Hauf, Time to split up: Dynamics of chromosome separation. Trends Cell Biol. 27, 42–54 (2017).

【3】 S. Luo, L. Tong, Molecular mechanism for the regulation of yeast separase by securin. Nature 542, 255–259 (2017).

【4】S. Hauf, I. C. Waizenegger, J. M. Peters, Cohesin cleavage by separase required for anaphase and cytokinesis in human cells. Science 293, 1320–1323 (2001).

【5】 L. Cromer et al., Centromeric cohesion is protected twice at meiosis, by SHUGOSHINs at anaphase I and by PATRONUS at interkinesis. Curr. Biol. 23, 2090–2099 (2013).