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蛋白质自聚集对蛋白稳定性和分子识别至关重要。扰乱蛋白同源聚集体是一种药物设计的新兴策略。通过直接破坏复合体，亚基嵌入或促进无活性低聚状态，可以实现对同源聚集体蛋白质的抑制。相比于靶向活性位点，靶向自聚集相互作用的优点在于能够刺激蛋白质降解，提高选择性，亚化学计量抑制以及绕过补偿机制。这种新的蛋白质抑制景观是由适合于研究同源聚集蛋白的生物物理和生化工具的开发驱动，例如差示扫描荧光法(DSF)，非变性质谱(native MS)，Förster共振能量转移(FRET)光谱，2D 核磁共振(NMR)和X射线晶体学。 ——生物学背景—— 1、蛋白-蛋白相互作用是在药物设计中广泛接受的范式 蛋白-蛋白相互作用(PPI)被广泛认为是细胞机制调节的关键之一。因此，靶向蛋白-蛋白相互作用已成为一种微调疾病中失调的蛋白质活性和生物过程的新策略。从癌症治疗到抗感染药物，针对PPI的成功疗法数量众多，可以被视为现代药物化学的伟大成就之一。市场上出现的生物制品以及针对 PPI 的小分子，如环孢菌素、替罗非班或PD-L1抗体只是其中的几个例子。 在过去的15年中，化学生物学的重要性日益增加，以及重大的技术进步开启了对具有挑战性的蛋白质界面的研究，包括靶向自聚集蛋白质。蛋白质同源聚集是一种普遍存在的现象，其失调可导致疾病。这些众多的PPI构成了尚未充分探索的潜在治疗靶标库。靶向蛋白质自聚集的一个早期例子是抗癌药物紫杉醇，它与β-微管蛋白结合，阻止微管的组装和拆卸。与经典的活性位点相比，靶向同聚复合物可以提供多种好处，已有不同的生物物理和生化方法已专门应用于这个新兴的药物设计领域。 2、同源复合物组装的原理 蛋白质自聚集在原核生物和真核生物中普遍存在。作为例证，大多数通过 X 射线晶体学解析的蛋白质结构采用同源二聚体或更高同源四级结构折叠。同聚复合物增加了蛋白质的稳定性。它们通过将疏水簇埋在单体界面上来减少其暴露于溶剂中。蛋白质稳定性通常随着其寡聚状态增加而增加，据报道，针对寡聚化界面的突变会显著破坏蛋白质稳定性。同源寡聚体还允许产生（近）对称结构，其存在可以减少聚集倾向、提高稳定性、降低合成错误以及增加折叠效率。此外，蛋白质自聚集可以通过使用最少的遗传空间来产生大分子结构。此外，从药物设计的角度来看，自聚集是生理功能的基础。事实上，无论是蛋白质-蛋白质还是蛋白质-配体相互作用，自聚集对于分子识别通常是必不可少的。
图1自聚集驱动各种分子识别的示意图 蛋白质活性位点的组装可能需要蛋白质自聚集。一些酶以同源寡聚体的形式发挥作用，其活性位点包含不同亚基。由TDO2编码的色氨酸-2,3-脱氧酶2是一种氧化还原酶，其活性位点由两个不同亚基结合构成。它的血红素辅因子负责全蛋白活性位点的正确折叠以及其寡聚化成活性四聚体。同源聚集还可以在不直接修改活性位点结构的情况下促进分子识别。在这种情况下，四级结构通常会提高复合物整体稳定性，从而间接地让活性位点保持合适的3D结构。从晶体学数据来看，大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶单体似乎是能够发挥催化活性的最小亚基。然而，实验表明，这种蛋白质在表现出生理相关的催化活性之前需要采用六聚体结构。这些发现扩展到膜受体，例如G蛋白偶联受体(GPCR)或酪氨酸激酶受体 (TKR)，其中异源和同源寡聚化对于下游信号传导至关重要。同样，转录因子的同源（和异源）聚集也是信号传递所必需的。信号转导和转录激活因子3(STAT3)是一种参与细胞增殖和存活的转录因子，其二聚化允许其易位到细胞核中并与其调节的基因启动子结合。另一个例子是表皮生长因子受体(EGFR)的二聚化。在结合其内源性配体后，EGFR胞外域和胞内域二聚化。这种二聚化激活 EGFR酪氨酸激酶功能，对下游信号传导至关重要。在过去的几年里，PPI作为药物靶点的兴起，以及对蛋白质自聚集微调作用的更广泛理解，引发了将破坏同源性作为药物设计新策略的新兴概念。 ——破坏同源复合物的优势—— 1、扩展成药性 与活性位点抑制相比，靶向自聚集存在优势。同聚界面构成了潜在的变构位点池，其靶向可导致蛋白质抑制和不稳定。因此，靶向这些寡聚界面可以为具有挑战性的目标提供新方法。STAT3是一种转录因子，可调节增殖、存活和其他生物过程。它的磷酸化促进了其同源二聚化，并且是易位到细胞核和促进基因表达所必需的。STAT3二聚体的形成强烈促进致癌作用和肿瘤进展。由于缺乏活性位点，这种转录因子一直被认为是具有挑战性的目标。然而，破坏STAT3二聚体的肽类和非肽类化合物的开发已经解锁了这种“不可药”蛋白质的靶向。另一个例子是Rad52蛋白。Rad52参与DNA修复和DNA同源重组。它采用七聚环超结构，这对其与DNA的结合至关重要。小分子对RAD52环的破坏使这种以前被认为是不可成药的DNA修复蛋白能够被靶向。 2、提高选择性 由于系统发育进化，蛋白质活性位点通常在同一家族中具有共同特征。由于这些相似性，可能会出现选择性问题，并且由于抑制同一家族的多种蛋白质，活性位点抑制剂通常会显示脱靶效应。然而，同源聚集界面通常不如活性位点保守，并且界面上常见辅因子或化合物的分子识别至关重要。因此，靶向这些不太保守且蛋白质特异性更高的位点是实现所需选择性的理想途径。
图2 靶向同源聚集界面可以解锁具有挑战性蛋白质的抑制并产生更多选择性配体 一个众所周知的蛋白质家族选择性问题的例子涉及蛋白激酶抑制。蛋白激酶是一个在细胞信号传导中起关键作用的蛋白质家族。因此，这些蛋白质形成了一类必不可少的治疗靶点，市场上有许多蛋白激酶抑制剂。然而，这些酶共享一个高度保守的 ATP 结合域。因此，通过活性位点抑制实现激酶选择性是一项挑战，并且许多抑制剂在激酶组之间表现出缺乏选择性。最近关于蛋白激酶寡聚干扰物的报道有希望对该家族实现选择性抑制。另一个可以通过靶向自聚集来实现选择性的治疗领域是抗感染剂领域。事实上，靶向病原体蛋白质需要对其人类宿主具有选择性。因此，针对寄生虫蛋白的寡聚界面，例如恶性疟原虫四聚苹果酸脱氢酶 (PfMDH) 或克氏锥虫二聚磷酸丙糖异构酶 (TcTIM)，已被建议作为实现选择性的新方法。 3、逃避补偿机制 靶向寡聚界面还可以绕过有时会遇到活性位点抑制剂的补偿机制。这些适应可以包括底物生物合成的增加、目标表达的促进或活性位点的突变。最近的一个例子涉及在癌症治疗中抑制RAF激酶家族。BRAF是该RAF家族的二聚体蛋白成员，是丝裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 级联反应的重要组成部分。BRAF是一种在人类癌症中经常发生突变的激酶。这些致癌突变导致 MAPK 通路的组成型过度激活，从而促进肿瘤发生。ATP 竞争性抑制剂，如维罗非尼vemurafenib，靶向以单体发挥作用的BRAF变体 V600E。尽管维罗非尼有效抑制单体 V600E 变体，但它也会导致野生型蛋白的激活。这种激活源于药物结合和无药物单体之间的二聚化增强，导致无药物亚基的反式激活（低浓度）。靶向BRAF二聚体界面的肽的已经在克服由vemurafenib 诱导的这种矛盾的 BRAF 激活方面取得了积极的结果。人胸苷酸合酶(hTS)是叶酸途径中的一种关键酶，在癌症治疗中以 5-氟尿嘧啶(5-FU) 为靶点。5-氟尿嘧啶(5-FU)是催化位点抑制剂 5-氟-2'-脱氧尿苷-5'-单磷酸酯的前药(FdUMP)。 hTS 可以通过与其 mRNA 的相互作用来调节其自身的表达。然而，FdUMP 对 hTS 的抑制会损害这种调节途径，通过蛋白质过表达导致抗性机制。有趣的是，使用在蛋白质二聚体界面相互作用的肽使 hTS 不稳定，成功抑制了 hTS，而不会导致其随后的补偿性过度表达，从而使其摆脱这种抗性机制。 与活性位点抑制剂相比，靶向病毒蛋白的自聚集也可导致病毒对药物的适应性降低。病毒对药物的耐药性通常与活性位点的单点突变有关，导致药物亲和力降低。例如，在 HIV-1 蛋白酶中，药物压力下的突变通常彼此靠近发生以相互补偿，同时赋予耐药性。这些协调的突变不太可能发生在复合体的二聚体界面中（界面对变异的耐受性较差）。从实际的角度来看，将这些变构抑制剂与活性位点抑制剂结合使用可能会导致较低的耐药率，例如针对 HIV 蛋白的联合治疗。
图3 靶向同源聚集体界面的抑制剂不太可能受到突变驱动的抗性 4、促进蛋白质不稳定和错误折叠 同源聚集体的破坏可导致蛋白质降解增加。事实上，破坏蛋白质会导致蛋白质不稳定，这可以作为蛋白质错误折叠的启动子。分子伴侣可以进一步识别和降解这些错误折叠的蛋白质。因此，破坏蛋白稳定性的化合物可通过诱导其错误折叠来促进蛋白质降解。 靶向自聚集还可以通过增强的蛋白酶体-蛋白质降解导致蛋白质周转增加。蛋白质周转是一种高度调节的机制，涉及短氨基酸序列的暴露，称为 degrons，它可以作为信号序列并导致细胞机器降解蛋白质。一些degrons在蛋白质寡聚体界面上被发现。更具体地说，在 90% 的人类蛋白质中都有的 N 端乙酰化会驱动特定的降解信号。这些 N 端乙酰化残基通常在寡聚蛋白的疏水核心内被屏蔽，因此泛素连接酶无法接近。靶向同源界面可导致degron暴露并促进蛋白酶体依赖性降解。因此，破坏自相互作用会导致蛋白质错误折叠以及促进蛋白质降解的信号序列的暴露。例如，靶向细胞凋亡抑制剂 (IAP) 基因家族成员survivin 的二聚体界面，可显着降低细胞蛋白质水平。与蛋白酶体抑制剂硼替佐米共同治疗挽救了这种蛋白质损失，并证明靶向这种癌蛋白的二聚体界面会通过泛素-蛋白酶体依赖性途径诱导其降解。最近通过蛋白水解靶向嵌合体（PROTAC）策略对蛋白质降解引起了相当大的兴趣。然而，蛋白质破坏对同源聚集体降解的影响尚未得到广泛研究。
图4 破坏同源聚集体可以促进蛋白质降解和错误折叠 5、亚化学计量 靶向同源界面可能导致亚化学计量的蛋白质抑制，两种主要机制可以解释这种影响。首先，同源性破坏会导致蛋白质错误折叠和降解。促进蛋白质降解会导致亚化学计量效应，因为一种抑制剂可以诱导几种蛋白质的降解。作为比较，使用 PROTAC 技术促进蛋白质降解通常会导致亚化学计量的蛋白质抑制。在多个亚基的界面上相互作用也会导致单个分子灭活完整的蛋白质复合物。与经典的 1:1 抑制相比，通过在活性位点相互作用，这种完整的复合物失活可以构成优势。事实上，低聚破坏剂的抑制曲线通常非常陡峭，希尔系数 >1，表明低聚破坏剂的协同效应。一个众所周知的例子是紫杉醇的作用方式。它与 β-微管蛋白结合，从而变构抑制微管的分解。在低浓度（低 nM）下，紫杉醇可以亚化学计量方式与微管结合，1 个紫杉醇分子可与微管中的多达 1000 个 β-微管蛋白分子结合。另一个例子是肿瘤坏死因子 (TNF) 细胞因子家族，其中一种抑制剂在三聚体蛋白的界面结合并使复合物失活（化学计量1:3）。 实现亚化学计量效应还可以解除对蛋白质的细胞抑制，否则由于它们的高细胞浓度而被认为是不可成药的。事实上，在化学计量比为 1:1 的情况下，基于细胞的活性位点抑制剂抑制通常不能低于其目标细胞浓度的阈值。作为癌症治疗的一个有吸引力的目标，乳酸脱氢酶 (LDH) 的细胞浓度范围在 1 到 10 μM 之间，具体取决于组织和癌细胞系。其活性位点抑制剂，由于其细胞中高蛋白质浓度，即使在低 nM 范围内表现出亲和力，也难以跨越μM 阈值抑制细胞。近来，一些通过靶向LDH四聚化位点的研究为抑制LDH的癌症治疗提供了新的途径。
图5 靶向同源界面可能导致亚化学计量的蛋白质抑制 参考文献： Thabault, Léopold, Maxime Liberelle, and Raphaël Frédérick. "Targeting protein self-association in drug design." Drug Discovery Today (2021). |
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