以CDK9为靶点的小分子抑制剂大盘点

小分子细胞周期蛋白依赖性激酶9抑制剂研究进展

侯少华1，葛崇勋2，赵立文2，江程3*

（1. 中国药科大学理学院，江苏 南京211198；2. 南京圣和药业研发中心，江苏 南京210000；3. 中国药科大学药学院药物化学系，江苏

南京210009）

[ 摘要] 由于细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK) 在细胞周期和转录调控过程中发挥的重要作用，其作为治疗癌症和其他一些疾病的重要靶点受到越来越多的关注。其中细胞周期蛋白依赖性激酶9(CDK9) 参与组成正性转录延长因子（P-TEFb），在转录调控过程中发挥关键作用，尤其是对于短寿命抗凋亡蛋白转录的调控，而短寿命抗凋亡蛋白对于多种肿瘤细胞的存活非常重要，CDK9 已成为治疗癌症的重要靶标。简介CDK9 的生物学信息，并以结构类型为分类依据重点介绍CDK9 抑制剂，以期为CDK9 选择性抑制剂的后续研究提供参考。

[ 关键词] CDK9；转录；抗肿瘤；抑制剂

 

CDK 属于丝/苏氨酸蛋白激酶家族，一般与细胞周期蛋白（cyclin）结合形成有活性的异源二聚体CDKcyclin复合物。每个CDK 家族成员都包含一个由ATP 结合口袋组成的催化中心、一个PSTAIRE-样与cyclin 结合的结构序列，一个与CDK 激活激酶（CAK）结合的激活区域T-loop 区域，cyclin 作为调节亚基，控制着激酶的活性和底物特异性。人类基因组编码21个CDK(1 ~ 11a、11b ~ 20）和超过15 个cyclin（A ~ L、O、T、Y）， 其中CDK4/cyclinD、CDK6/cyclinD、CDK2/cyclinE 参与调控G1 期和G1 期到S 期的过渡，CDK1/cyclinA、CDK1/cyclinB 和CDK2/cyclinA 参与调控S、G2、M 期，CDK7/cyclinH、CDK8/cyclinC、CDK9/cyclinT、CDK11/cyclinL 在转录调控中发挥重要作用。CDK7 具有激活参与细胞周期调控的其他CDK 亚家族和参与转录调控的双重作用，其他的CDK 亚家族在更多特定细胞类型的特定过程中发挥作用。

CDK 的激酶活性除受到cyclin 的正性调节和内源性蛋白抑制因子（CDKI）的负性调节外，还受到自身磷酸化状态的影响。根据CDKI 与CDK 或CDKcyclin复合物结合大体上可将CDKI 分为两类：一类是INK 家族，研究较多的是P15、P16、P18、P19，它们通过与CDK4/6 结合来阻止其与cyclin 调节亚基结合；另一类是cip/kip 家族，它们与CDK-cyclin 复合物结合，主要作用于cyclinD、E、A、B 依赖性激酶复合物，包括P21、P27、P57 。抑制性激酶wee1 和Myt1 通过磷酸化CDK 中ATP 结合位点的14 位Thr 和15 位Tyr 来干涉CDK 与ATP 的结合，CAK 通过磷酸化CDK 中T-loop区域的161 位Thr 来提高其底物结合能力和复合物稳定性，进而实现整个CDK 的激活。

肿瘤的发生往往伴随着细胞的过度活化和持续性增殖，而CDK 在细胞内外信号的调节下对细胞周期和转录过程发挥着重要的调控作用。在癌细胞中，CDK-cyclin 的活性往往是失调的，可能的原因包括：信号传导通路的过度激活、cyclin 的过度表达、CDK的异常扩增、内源性抑制因子的失活或缺失，这些启发着人们通过不断寻找新型的CDK 抑制剂来发展肿瘤治疗技术。CDK 已成为肿瘤治疗的重要靶标，近20 年来，寻找抑制CDK 的抗肿瘤药物已成为研究的热点领域，化合物1 ~ 10 为已上市或处于临床研究阶段的CDK 抑制剂。

三磷酸腺苷（ATP）作为CDK 的辅因子，可以认为其是发现CDK 抑制剂的先导化合物。已经有许多ATP 竞争性CDK 抑制剂进入临床研究，它们往往具有由杂环或疏水性芳香环组成的平面结构，第1代CDK 抑制剂非选择性作用于CDK 家族，是广谱的CDK 抑制剂，如flavopiridol（1）和roscovitine（2）等。

相较于第1 代非选择性CDK 抑制剂，第2 代选择性CDK 抑制剂往往具有更强的活性、更好的选择性以及更好的类药性，其中辉瑞公司研发的CDK4/6 选择性抑制剂palbociclib（10），于2015 年2 月获美国FDA 批准与雌激素疗法联合用于雌激素受体阳性的乳腺癌治疗。CDK4/6选择性抑制剂LEE-011（8）于2017 年获FDA 批准在美国上市，与芳香化酶抑制剂联合用于治疗绝经后妇女的雌激素受体阳性/人类表皮生长因子受体2 阴性的晚期或转移性乳腺癌（数据来源：Integrity，检索日期：2017-04-20）。

1 CDK9 的生物学

CDK9 主要参与转录调控过程， 由CDK9 和cyclin（T1、T2a、T2b、K）组成的异源二聚体参与组成正性转录延长因子（P-TEFb）。其中CDK9有2 种亚型，相对分子质量分别为42 000 和55 000，后者比前者在N 端多出117 个氨基酸。约有80% 的CDK9 与cyclinT1 结合，各有10% 的CDK9 分别与cyclinT2a 和cyclinT2b 结合，在部分组织中发现有CDK9 与cyclinK结合。CDK9 功能的调控是一个包括翻译后修饰（关键残基的磷酸化/去磷酸化、乙酰化/去乙酰化）的复杂网络，甚至P-TEFb 与各种蛋白的结合能够对激酶活性产生激活或抑制作用。此外，与cyclin 结合对于CDK9 的激活是必须的，其所处环境对激活模式起决定作用。

CDK9 具有经典的蛋白激酶折叠，由C-端和N-端激酶域及一个小的C-端延伸区组成。ATP 结合位点位于C-端和N-端激酶域之间，由高度保守的激活位点残基组成，调节与ATP 的结合和磷酸转移作用。CDK9 与抑制剂结合的晶体复合物结构研究表明，CDK9的ATP 结合口袋中的许多片段，如铰链区、G-loop区域、α-螺旋具有比其他CDK 亚家族更好的柔韧性，这种柔韧性对于CDK9 适应不同的结合环境很重要，有利于寻找得到特异性的CDK9 抑制剂。

由RNApol II 所催化的转录是一个多步骤过程，包括：起始前、起始、启动子清除、延长和终止。RNApol II 大亚基的C 端结构域包含串联的七肽重复序列：YSPTSPS，该序列上的Ser 和Thr 的磷酸化在转录过程中起重要作用。转录因子TFIIH 复合物中的CDK7通过磷酸化5 位Ser 来激活RNApol II 进而推动转录起始，转录起始后，由于核苷类似物DRB（11）敏感的诱导因子（DSIF）和负性延长因子（NELF）的影响，RNApol II 会在添加一些核苷酸后停止发挥作用，P-TEFb 复合物中的CDK9 磷酸化RNApol IICTD 2 位Ser 的同时，也会磷酸化DSIF 和NELF。磷酸化会使NELF 离去，同时会使DSIF 转化为正性转录因子，随后RNApol II 进入转录延长模式，转录延长过程启动。

CDK9 作为P-TEFb 的亚单位参与转录的延长过程，在转录过程中发挥重要作用。CDK9 调控短寿命抗凋亡蛋白的RNA 转录，这是CDK9 作为抗肿瘤靶标的重要基础。抑制CDK9 会导致抗凋亡蛋白Mcl-1、XIAP 等的下调，而这些抗凋亡蛋白具有维持肿瘤细胞稳定性的能力，从而诱导肿瘤细胞的凋亡 。CDK9 还参与许多细胞功能的调节，这些功能中有许多都对肿瘤细胞存活具有重要意义。选择性地抑制CDK9 还可以作为肿瘤侵袭和转移的潜在治疗策略。

CDK9 在前列腺癌细胞的发展过程中发挥重要作用，它通过磷酸化雄激素受体（AR）的81 位Ser 来影响下游通路Myc、NF-κB 和STAT 家族的调控，而Myc和NF-κB 在前列腺癌细胞中往往过表达。此外，CDK9还通过磷酸化RNApol II 来调控抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1 和XIAP 的表达。CDK9 在发挥转录调控作用之前，需要先被Bromodomain 4（BRD4）蛋白招募至转录起始位点处，CDK9 抑制剂和BRD4 抑制剂在包括肺癌在内的多种临床前肿瘤模型中表现出协同作用。

2 CDK9 抑制剂

不同CDK 亚家族间的ATP 结合口袋具有高度同源性，ATP 竞争性CDK 抑制剂对不同CDK 具有较差的选择性，临床试验中往往产生较多副作用，为药物研发带来困难。某些抑制剂通过与传统的化学疗法联用产生了更好的临床效果，同时寻找非ATP 竞争性CDK 抑制剂也是提高选择性的重要手段。

目前开发的CDK9 抑制剂按其母核结构大致分为：黄酮类、嘧啶类、吡唑类、吡啶类、苯三嗪类、嘌呤类、其他类。其中一些CDK9 抑制剂与CDK9 的结合较为特殊，对实现CDK9 选择性抑制具有积极意义，故对其结合模型进行了大致的介绍。几乎所有的CDK9 抑制剂通过与CDK9 铰链区残基的相互作用而结合，结合过程中，往往会与铰链区残基中氨基酸羰基上的氧原子和胺基上的氢原子形成分子叉状分子间氢键。

2.1 黄酮类化合物

化合物1 是一种半合成黄酮类生物碱衍生物，作用于CDK1、2、4、6、7、9（IC50 分别为300、161.4、100、100、300 和2.5 nmol · L-1），它是研究最为深入的第1 代CDK 抑制剂，已进行了多项Ⅰ、Ⅱ期临床试验，目前尚无Ⅲ期临床结果报道。2007 年欧盟授予化合物1 治疗慢性淋巴细胞白血病（CLL）的孤儿药资格，2014 年和2015 年，美国和欧盟依次授予其治疗急性骨髓性白血病（AML）的孤儿药资格（信息来源：Integrity，检索日期：2016-10-16）。

化合物1 是一种对多种肿瘤细胞具有生长抑制活性的CDK 抑制剂，是目前进行临床试验最多的CDK9抑制剂，目前化合物1 单独使用或与其他药物联用已进行了60 多次关于多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤、肉瘤和实体瘤的临床试验。研究表明，化合物1 在与其他抗肿瘤细胞增殖药物联用于恶性胶质瘤治疗方面很有潜力。目前对化合物1 进行了一些有关治疗CLL的临床试验，由于其毒性作用，人们开发其作为治疗CLL 药物的热情逐渐减退。化合物1 通过抑制CDK9的活性抑制HIV-ITat 蛋白的反式激活和病毒的复制，但在长期细胞试验中出现抗病毒活性下降和相关细胞的毒副作用。构效关系研究表明，其母核结构2-位苯环上取代基的大小和位置对活性和选择性有重要影响；提高2 位取代基的疏水性将导致细胞毒作用的下降。

化合物1 与CDK9/cyclinT 的共晶结构表明：化合物1 的大部分结合在CDK9 的ATP 结合口袋中，CDK9 中的G-loop 区会折叠并覆盖在活性位点上，增强疏水性残基和化合物1 之间的范德华力作用。G-loop区中的30 位Phe 还与化合物1 的哌啶环形成疏水性作用。此外，CDK9的β3/αC-loop区的构象改变会将G-loop的闭合构象锁定，这也在一定程度上解释了化合物1与CDK9 的紧密结合（见图1）。

化合物12（P276-00）是一种新颖的CDK9 抑制剂，可选择性抑制CDK1、4、9（IC50 分别为79、63 和20nmol · L-1），可抑制RNApol II 的磷酸化并下调Mcl-1，在纳摩尔级（IC50 ≈ 300 ~ 800 nmol · L-1）即具有抑制肿瘤细胞生长的能力，且相对于正常纤维原细胞具有较好选择性。研究表明其对结肠癌、胃癌、乳腺癌细胞等的抗增殖能力约是顺铂的30 倍；对结肠癌、宫颈癌、肺癌细胞等的抗增殖能力是flavopiridol的2 ~3 倍。体内试验表明，化合物12 对前列腺癌细胞PC-3 异种移植瘤具有显著疗效，且体外试验表明其对人脐静脉内皮细胞瘤的形成和前列腺癌细胞的迁移也具有抑制作用。

化合物13（wogonin）是从中药黄芩中提取出的有效活性成分，是一种与flavopiridol 具有相似结构的CDK9抑制剂（ 对CDK9 和7 的IC50 分别为0.19 和12.3 μmol · L-1），其能够阻滞RNApol II 大亚基C- 端结构域的磷酸化，阻滞RNA 合成，下调Mcl-1，进而诱导多种肿瘤细胞的凋亡，如白血病T 细胞。

2.2 嘧啶类化合物

嘧啶是许多激酶抑制剂中的重要母核结构，化合物14 是以嘧啶氨基为基础经一系列优化得到的CDK9 选择性抑制剂（对CDK9、7 和2 的Ki 分别为7、46 和568 nmol · L-1）。化合物14 相对于CDK2 对CDK9 有约80 倍的选择性，相对于正常B 细胞和T 细胞对原始慢性淋巴白血病细胞有约31 倍和107 倍的选择性。在化合物14 与CDK9 的晶体复合物中，1, 4-二氮杂环采取了一种向内的构象伸向噻唑环，然而在化合物14 与CDK2 的晶体复合物中，1, 4-二氮杂环采取了多重构象；与CDK2 相比，由于铰链区灵活的残基骨架，化合物14 更好地占据了CDK9 的ATP 结合口袋；再者，与抑制剂结合之后，CDK9 中灵活的G-loop 区域有一个伸向ATP 结合口袋的构象改变，在CDK2 中则未发现这种改变，这说明与CDK2 相比，CDK9 具有更大和更加灵活的ATP 结合口袋。

化合物15 靶向作用于CDK9 且具有较强的抑制活性（对CDK9、2、4 和6 的 IC50 分别为44 nmol · L-1、2.44 μmol · L-1、9.24 μmol · L-1 和大于10 μmol · L-1），其选择性优于flavopiridol 和DRB。化合物15 在体外以ATP 竞争性和剂量依赖性的方式抑制转录，选择性下调参与增殖调控的短寿命mRNAs 。后经过电子等排体替换优化筛选得到了结构类似且活性和选择性均较好的化合物16（对CDK9 的IC50 为142 nmol · L-1）。虽然化合物16 对CDK9 的抑制活性弱于化合物15，但其对CDK9 的激酶选择性更好，化合物15 作用于CDK9 的同时对GSK3A 和HGK/MAP4K4 也具有较强抑制活性，而化合物16 在体外能在控制HIV-1 复制的同时较少作用于其他激酶，毒副作用更少。

吲哚生物碱是存在于海洋无脊椎动物中一类重要的生物活性分子，Meridianin 是一类从海鞘类Aplidiummeridianins 中分离得到的一类含有3-（2-氨基嘧啶）吲哚结构的生物碱，随后，对meridianin 及其类似物进行了化学合成和激酶抑制活性的测试，化合物17(meridianinA) 是其中的代表化合物（对CDK1、2、5、9 的IC50 分别为2.5、3.1、3.0、2.4 μmol · L-1）。从海绵Kirkpatrickia variolins 中提取得到的variolins 是另一类与meridianin具有结构同源性的天然产物，化合物18（variolinsB）是其中的代表化合物（对CDK1、CDK2、CDK5、CDK9 的IC50 分别为60、80、90 和26 nmol · L-1）。化合物19（meriolins）则是一类糅合了meridianin 和variolins两类化合物结构特征的CDK抑制剂，具有较强的CDK 抑制活性和抗肿瘤细胞增殖活性且明显优于其母体结构meridianin 和 variolins，其中的代表化合物20（meriolin3）显示出对CDK9 较好的活性和选择性（其对CDK1、2、5、9 的IC50 分别为170、11、170 和6 nmol · L-1），化合物20 能够抑制Rb蛋白和RNApol II 的磷酸化并下调Mcl-1，其对结直肠癌LS 174T、骨髓癌KMS-11、神经胶质瘤GBM 和成神经细胞瘤SH-SY5Y 的IC50 分别为0.13、0.12、0.14、0.072 μmol · L-1 。化合物19 在胶质瘤和瘤内内皮细胞中表现出较很好的抗增殖和促凋亡活性，是一类治疗恶性胶质瘤很有前景的先导化合物。

以大环化合物21 为基础经进一步优化得到了大环类多激酶化合物22（TG02），后者能够抑制CDK1、2、5、7、9（IC50 分别为9、5、4、37 和3 nmol · L-1）以及JAK2 和FLT3 的下游信号传导通路；其通过抑制CDK9 表现出抗肿瘤活性，在多种肿瘤细胞中引起了Mcl-1 的下调和p53 依赖的凋亡。化合物22 曾作为单一药物处于治疗 CLL 的Ⅰ期临床，并进行了与卡非佐米联合用于治疗多发性骨髓瘤（MM）的Ⅰ期临床；化合物22 与ABT-737、ABT-199 在细胞毒机制上互补，对于治疗AML 患者会产生较强的协同作用。

与化合物22 具有相同氨基嘧啶结构的化合物23（CDKI-73） 同样对CDK9 具有较强抑制活性（ 对CDK1、2、7、9 的Ki 分别为4、3、91 和4 nmol · L-1），其能够诱导CDK9 和RNApol II 的去磷酸化，进而诱导半胱天冬酶依赖的肿瘤细胞凋亡，相对于正常CD34 细胞对原始白血病细胞有大于200 倍的选择性；在诱导白血病细胞凋亡方面，与氟达他滨具有细胞毒协同作用。化合物23 对乳腺癌细胞系A2780 的IC50 为0.007μmol · L-1 。在下咽骨鳞状细胞癌（HSCC）细胞中，化合物23 通过抑制CDK9 的活性显著下调Mcl-1，单一或者与顺铂协同诱导HSCC 细胞系的凋亡，是一种新的HSCC 潜在治疗策略。

2.3 吡唑类化合物

氨基吡唑是一种能够有效模仿ATP 中腺嘌呤的母核结构，以氨基吡唑为母核的化合物作为CDK 抑制剂不断被研究。经化合物库筛选和结构优化得到了化合物24（CAN508）（对CDK1/2/4/7 的IC50 均大于10 000 nmol · L-1，对CDK9 的 IC50 为350 nmol · L-1），其是一种ATP 竞争性CDK 抑制剂，能降低Rb 蛋白和RNApol II CTD 的磷酸化。化合物24 对CDK9 具有较好的抑制活性，可能是由于酚羟基与CDK9 的 ATP 结合口袋中66 位Glu 之间的氢键作用；其对CDK9 较强的选择性可能归因于明显的分子灵活性促进了与CDK9的结合；其靶向作用于P-TEFb，在多种人类肿瘤细胞中降低血管内皮细胞生长因子的表达，能够抑制内皮细胞的移行和血管的生成，是抗血管生成的潜在治疗手段。

对吡唑母核的优化得到了临床候选化合物4（AT7519），其是一种ATP 竞争性抑制剂（对CDK2、4、6 的IC50 分别为47、100、170 nmol · L-1，对CDK9 的IC50 低于10 nmol · L-1），对多发性骨髓瘤细胞具有较强的抑制活性，能够诱导凋亡，抑制RNApol II 磷酸化；其对肿瘤细胞的抑制作用主要是由对CDK5、CDK9、GSK3b 的抑制所引起。目前已对化合物4 进行了关于套细胞淋巴瘤、CLL 和多发性骨髓瘤的Ⅱ期临床试验，以及与HSP90 抑制剂联合用于外科手术不可切除的转移性实体瘤Ⅰ期临床试验( 试验代号：NCT02503709）。化合物4 能在更低浓度下杀灭MYCN基因扩增的成神经细胞瘤细胞系，是MYCN 基因扩增的高风险成神经细胞瘤患者的潜在治疗药物。

化合物25（RGB286638）是一种具有茚并吡唑母核结构的广谱CDK 抑制剂（对CDK1 ~ 7 的IC50 为2 ~55 nmol · L-1，对CDK9 的IC50 为1 nmol · L-1），已进行了治疗实体瘤的Ⅰ期临床试验，由于其毒副作用，目前26 27 2824 25该项目已被终止。化合物25 是一种活性较强的CDK9抑制剂，可以诱导RNApol II 的下调并抑制转录，产生半胱天冬酶依赖的凋亡诱导作用。

作为Bcl-2家族成员，Mcl-1 是多种肿瘤细胞存活和凋亡的关键调控蛋白。对于AML 患者，Mcl-1 的过度表达往往伴随着较差的预后；Mcl-1有助于修复不同的基因损伤，进而能够激活和维持小鼠AML 肿瘤细胞的生长。在宫颈癌细胞中往往出现Mcl-1的过度表达。这些为筛选能够直接下调Mcl-1 的抑制剂奠定了基础。化合物26（PIK-75）最初被认为是一种ATP 竞争性CDK 抑制剂，选择性作用于CDK2、7、9（ 对CDK9 的IC50 为1.37 nmol · L-1， 对CDK2、7、9 的Kd 分别为540、2.5 和4.1 nmol · L-1），直接抑制Mcl-1，后来发现其同样是一种下调Mcl-1 的PI3Kα 抑制剂（IC50=0.5 nmol · L-1）。为了提高选择性活性，通过构效关系研究设计合成得到含有吡唑并嘧啶母核的化合物27（对 PI3K、CDK7、CDK9 的IC50 分别为2 960、3 590、22 nmol · L-1）和化合物28（对PI3K、CDK7 的IC50 均大于10 000 nmol · L-1，对CDK9 的IC50为203 nmol · L-1），分子对接显示吡唑并嘧啶母核占据了CDK9的ATP 结合口袋，2，5-二取代苯基决定了磺酰胺基的定向。主要的相互作用是与103 位Phe 之间形成的卤-π 相互作用，然而将Br 用Cl 替换后将导致活性的显著下降；将CN 用NO2 替换后将导致选择性的改变；将化合物27 中代谢不稳定的腙替换成化合物28 中的氨基将使活性下降然而保持了对CDK9的选择性。

研究人员使用以有效性和耐受性为参数的体内筛选方法得到了化合物3（dinaciclib），其是一种吡唑并嘧啶类强效CDK 抑制剂，选择性作用于CDK1、2、5、9（IC50 分别为3、1、1 和4 nmol · L-1）。2011年FDA 授予化合物3 治疗CLL 的孤儿药资格；默克公司推动其进入治疗顽固性CLL 的Ⅲ期临床试验。化合物3 可以下调CLL 细胞中Mcl-1 的表达，同时下调由多种在CLL 细胞微环境中比较重要的可溶性蛋白所调控的对抗性保护；其通过对CDK9 的抑制下调了cyclinB1、cMYC 等蛋白水平，具有对三阴性乳腺癌细胞的生长抑制活性。化合物3 能够使成神经细胞瘤细胞对doxorubicin 和etoposide 等化疗药物更加敏感；其在2 种成神经细胞瘤细胞系的原位异种移植小鼠模型中具有体内抗肿瘤活性，能够阻滞转基因成神经细胞瘤小鼠模型肿瘤的发展。在弥散性大B 细胞淋巴瘤（DLBCL）中，抗凋亡蛋白Bcl-2 和Mcl-1 往往频繁过度表达，化合物3 能够通过抑制CDK9 下调Mcl-1，却提高了Bcl-2 的活性；BH3 类似物ABT-199 却能有效靶向作用于Bcl-2，若将化合物3 和ABT-199 联用则可实现协同作用，在DLBCL 中表现出强抗肿瘤活性。此外，化合物3 与MK-2206 在抑制胰腺肿瘤细胞生长和人源性肿瘤组织异种移植模型代谢方面也具有协同作用。

化合物29（LY2857785） 是一种可逆性ATP 竞争性抑制剂，选择性作用于CDK7、8、9（IC50 分别为246、16 和11 nmol · L-1），转录抑制是其主要作用模式。化合物29 具有较好的激酶选择性、较高的水溶性、溶液中良好的稳定性及很好的生化特性；其活性与flavopiridol 相当，在多种肿瘤细胞中具有抑制活性，尤其是AML 和其他一些血液肿瘤细胞（IC50 ＜ 50nmol· L-1）。化合物29 在血液肿瘤细胞中能够降低Mcl-1 和XIAP 的表达。人体外骨髓移植形成分析方法和动物毒性研究表明，化合物29 会以剂量依赖和时间依赖的方式对一些正常血液细胞产生增殖抑制作用；动物毒理学研究表明，化合物29 对一些关键器官产生剂量依赖性毒性，如骨髓和胃肠道，这些限制了化合物29 的临床应用。

化合物30（BS-194）对CDK2、5、9 具有很强的抑制活性（IC50 分别为3、30、90 nmol · L-1），此外，其对胞外调节蛋白激酶8（ERK8）具有较强抑制活性，ERK 家族是另一类丝氨酸/苏氨酸激酶，在细胞生长和分化过程中发挥重要作用；动物研究表明，化合物30在25mg . kg-1 . d-1 的口服剂量下可以明显抑制异种移植瘤的生长并且不会导致动物体质量的明显下降。

2.4 吡啶类化合物

诺华公司合成了一系列以吡啶为母核的化合物，得到了对CDK9 具有纳摩尔级抑制活性的化合物31（IC50=1 nmol · L-1），后经优化得到了对CDK9 选择性更强的化合物32（对CDK1/2/3/5 的IC50 为94 ~ 1 077nmol · L-1， 对CDK9 的IC50 为3 nmol · L-1） 和化合物33（对CDK1/2/3/5 的IC50 为913 ~ 1 877 nmol · L-1，对CDK9 的 IC50 为10 nmol · L-1）。后来又系统优化了联吡啶类化合物，得到了有较强CDK9 抑制活性的化合物34（IC50=8 nmol · L-1）。

化合物35（PHA767491）是一种有效的ATP 竞争性CDK 抑制剂，选择性作用于CDK7、9（IC50 分别为34 和10 nmol · L-1）；其能够以p53 依赖的方式诱导肿瘤细胞凋亡，曾进行了关于实体瘤的Ⅰ期临床试验，目前已终止。化合物35 能够下调对CLL 细胞存活具有关键作用的Mcl-1 和XIAP 蛋白，靶向作用于肿瘤细胞的存活和增殖双重途径，诱导细胞凋亡，是CLL 的潜在治疗药物。

2.5 苯三嗪类化合物

拜耳公司研发团队研究开发苯三嗪类化合物作为CDK9 抑制剂，其中化合物36、37 对CDK9 具有很好的选择性（对CDK2 的IC50 分别为 89、260 nmol · L-1；对CDK9 的IC50 分别为3 和2 nmol · L-1）； 同时对Hela、DU145、Caco-2 和B16F10 等一系列肿瘤细胞具有很好的抑制活性。

作用于P-TEFb 的CDK9 抑制剂38（BAY1112054）具有纳摩尔级激酶抑制活性，相较其他CDK 亚家族，其对CDK9 具有约50 倍的选择性；对多种人类肿瘤细胞系的IC50 约为1 μmol · L-1。然而化合物38 在吸收、分布、代谢和排泄（ADME）的一些方面存在问题，如水溶性较差、药物外排作用过强。在此基础上经过一系列优化，得到了活性更好、选择性更强的化合物39（BAY1143572），其具有很好的水溶性，适中的口服生物利用度，同时药物外排作用降低，在多种肿瘤细胞系中表现出很好的细胞抑制活性；目前处于Ⅰ期临床阶段，评估其用于癌症晚期病人的安全性和耐受性。

2.6 嘌呤类化合物

化合物2（roscovitine）是一种嘌呤类ATP 竞争性CDK 抑制剂，对CDK1、2、5、7、9 具有较强抑制活性（IC50 分别为650、700、160、460 和600 nmol ·L-1），对CDK4、6 的抑制活性较弱（IC50 均大于100μmol · L-1），是癌症、病毒感染等多种疾病的潜在治疗药物。

化合物2 能够在人类乳头状瘤病毒（HPV）阳性的头颈部肿瘤细胞中引起DNA 损伤和p53 依赖的细胞凋亡，低剂量的化合物2 即能显著抑制HPV 相关的小鼠移植瘤细胞的生长，同时对正常细胞无明显的毒副作用；化合物2 通过对CDK5、9 的抑制阻滞了内皮激活和白血球与内皮细胞的相互作用，这使其可能成为一种有效的抗炎药物。目前其处于治疗库欣综合征的Ⅱ期临床（试验代号：NCT02160730）。化合物2的不足之处是半衰期较短和快速代谢，通过对其构效关系分析优化得到的类似物不断被报道。

化合物40（CR8） 是一种新型的作用更强的roscovitine 类似物，作用于CDK1、2、5、9（IC50 分别为150、80、120 和110 nmol · L-1），与roscovitine一样可以剂量依赖性地诱导神经母细胞瘤细胞（NB细胞）的凋亡，在多种NB 细胞系中可以下调Mcl-1，这可能与其对CDK9 的直接抑制有关。化合物40 与CDK9 的共晶结构表明，化合物40 的嘌呤环7位N 原子和6 位胺基与CDK9 的铰链区106 位Cys 残基之间形成氢键结合作用，化合物40 的嘌呤环被包夹在疏水性残基25 位Ile 与156 位Leu 之间；苯基吡啶暴露在溶剂可及区，在与化合物40 结合之后，CDK9 的G-loop 区有向下移动并闭塞抑制剂结合位点的趋势（见图2），这在一定程度上解释了化合物40对CDK9 的选择性。

化合物41（CYC065）是一种新型的第2 代氨基嘌呤类CDK 抑制剂，选择性作用于CDK2、9（IC50 分别为5 和26 nmol · L-1）。其能够快速降低RNApol II2 位Ser 的磷酸化，抑制参与细胞周期调控、细胞存活、白血病发生的蛋白的表达，如Mcl-1、CyclinE、PNUTS、Hoxa9 和Meis1，并能够快速有效地诱导肿瘤细胞的凋亡，是AML 和MLL 的潜在治疗药物，目前正进行关于实体瘤的Ⅰ期临床试验。

2.7 其他类化合物

化合物11（DRB）对CDK9 具有较高选择性（对CDK2、4、6 的IC50 均大于10 μmol · L-1， 对CDK9的IC50 为3 μmol · L-1），其通过卤-π 键的形成阻滞CDK9 的ATP 结合口袋，进一步诱导CDK9 G-loop 构象的改变，这种改变又促进了抑制剂分子的结合，这对设计选择性CDK9 抑制剂具有启发作用。在化合物11与CDK9/cyclinT1 复合物的结合模型中，化合物11 能够竞争性结合到ATP 结合口袋，其结构中的苯并咪唑基团结合到ATP 结构中腺嘌呤的结合位点上，苯环上的氯原子能够与铰链区产生相互作用，分别与106 位Cys 和104 位Asp 主链上的氧原子形成卤键作用，这种卤-π 键结合作用对化合物11 与CDK9 的特异性结合起决定性作用（见图3）。

化合物6（SNS032）作为一种选择性CDK 抑制剂，主要作用于CDK2、7、9（IC50 分别为38、62、4nmol · L-1）；其曾进入B-细胞恶性肿瘤、多发性骨髓瘤、实体瘤的Ⅰ期临床试验，但目前已终止（试验代号：NCT00446342，NCT00292864）。化合物6 能显著诱导人类急性髓性白血病细胞HL-60 的凋亡，其机制可能与抑制JAK2 和STAT3 磷酸化、抑制Mcl-1 和cMYC 及与之相关的miR-17-92 基因簇的表达有关；其能够显著诱导RNApol II 2 位和5 位Ser 的磷酸化并阻滞RNA 合成，下调Mcl-1 和XIAP，其还能够抑制小鼠中乳腺癌异种移植模型的生长，并能够诱导CLL 细胞的凋亡。化合物6 在神经母细胞瘤细胞中获得性耐药的主要抗性机制是ABCB1 的表达，ABCB1抑制剂可能会提高化合物6 在ABCB1 表达的神经母细胞瘤细胞中的活性。

3 总结和展望

CDK 作为治疗肿瘤和其他一些疾病的重要靶点，近20 年来已有许多CDK 抑制剂进入临床，并已有选择性CDK4/6 抑制剂上市，这为研发选择性CDK 抑制剂带来信心和希望。CDK9 作为新颖和具有巨大潜力的抗肿瘤药物靶标，受到越来越多的关注，已有多个选择性CDK9 抑制剂进入临床，以CDK9 作为抗肿瘤药物靶标具有广阔应用前景。

CDK9 在转录的多个方面发挥重要作用，参与组成P-TEFb，对于维持短寿命抗凋亡蛋白（如Mcl-1）的较高水平非常关键。相较其他CDK 亚家族，CDK9 的ATP 结合口袋里的铰链区、G-loop 区和Cα-helix 具有更好的柔韧性，能够适合不同的结合环境，有利于与抑制剂分子的选择性结合；CDK9 除了是抗肿瘤药物的重要靶标外，同时也是抗HIV、抗炎等许多疾病的有效靶标。目前存在的问题是一些抑制剂对CDK9 的选择性不足，往往同时作用于其他CDK 亚家族，这将带来毒副作用，开发具有更高选择性的CDK9 抑制剂将是努力的方向。

目前普遍认为提高CDK 激酶选择性会产生更好的肿瘤治疗效果，如FDA 已批准上市的CDK4/6 选择性抑制剂10 和非选择性CDK 抑制剂1、2 的对比支持了这一观点。然而有化学蛋白质组学研究发现，化合物10 还是一种对脂质激酶具有较强活性的CDK9 抑制剂。有些CDK9 抑制剂作用于CDK9 的同时也作用于其他激酶，这有时会对癌症治疗有利，比如作用于CDK9 的同时又下调其他类型抗凋亡蛋白（如Bcl-xL）的CDK9 抑制剂。由于目前关于CDK9 抑制剂的许多研究中体内和体外活性分析的关联性不强，所以提高激酶选择性是否一定会产生更好的肿瘤治疗效果需要更加全面的临床前和临床研究来证明。

 

[ 专家介绍] 江 程：副教授，硕士生导师。2007 年毕业于中国药科大学，同年留校任教。2013 年3 月至2014 年3月美国密歇根大学癌症研究中心访问学者。主要研究方向：生物活性分子的设计与合成。主持国家自然科学基金项目两项，江苏省自然科学基金一项，参与“863”、“国家新药创制重大专项”等多项国家级和省部级项目的研究工作。2008 年获第十一届中国药学会-施维雅青年药物化学奖。2012 年获江苏省“青蓝工程”优秀青年骨干教师培养对象。目前已发表论文20 余篇。

●感谢您阅读《药学进展》微信平台原创好文，也欢迎各位读者转载、引用。本文选自《药学进展》2017年第7期。