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今天介绍的文章是著名的美国Joslin糖尿病中心2019年5月10日在国际权威糖尿病杂志《Diabetes Care》（影响因子：15.270）上发布了新的成果：通过血浆蛋白质组和血浆代谢组联合应用寻找到糖尿病肾病（Diabetic Nephropathy , DN）的循环标志物，希望对于想开展蛋白质组学与代谢组学实验设计和数据分析的老师和同学有所帮助。
来自国际权威杂志Diabetes Care报道：蛋白质组学和代谢组联合应用为糖尿病患者带来福音 关键词：Label free定量蛋白质组，代谢组，糖尿病，循环标志物 2003年，国际著名的美国Joslin糖尿病中心启动了糖尿病研究领域非常著名的研究项目—Joslin “50年奖章”研究（50-Year Medalist Study，本文简称Medalist研究）项目，本项目招募了上千名有着50年以上糖尿病史的患者进行研究，希望确定是否存在保护因素来预防糖尿病患者严重并发症（如视网膜病变、肾病和心血管疾病）的发生，这些保护因素的发现将为全世界数百万糖尿病患者的治疗带来福音。 2019年5月10日，Medalist项目两位发起人George L. King和Hillary A. Keenan的研究团队在国际权威糖尿病杂志《Diabetes Care》（影响因子：15.270）上发布了新的成果：通过血浆蛋白质组和血浆代谢组联合应用寻找到糖尿病肾病（DN, Diabetic Nephropathy）的循环标志物，现对于该文章的主要研究内容进行解析。 1. 临床患者分组研究设计的流程图（如图1所示）
图1 Flowchart of Study Design and Subsets. 2. 利用免疫印迹法研究肾脏组织中葡萄糖代谢酶和TCA循环的关键酶（如图2所示） 作者对1型糖尿病(n=15)、2型糖尿病(n=19)和非糖尿病(n=5)逝者进行遗体解剖，利用免疫印迹法分析了肾小球的葡萄糖代谢关键酶（糖酵解、AR和乙二醛酶）和TCA循环进行了免疫印迹研究，分析结果表明2型糖尿病患者的pkm2表达水平显著低于对照组；与对照组比较，2型和1型糖尿病患者糖酵解（pkm1、tpi1和eno1）、TCA循环（mtco2）、AR和乙二醛酶途径中的其他酶均呈现下降的趋势。 在2型糖尿病患者中，与肾功能保存的患者相比，严重CKD患者的pkm2水平显著降低；同样，pkm1和eno1的水平在严重CKD患者中也显著增加，而glo1则具有提示意义；组织学分级为无至轻度CKD的2型糖尿病患者TPI1和GLO1的表达高于中度至重度CKD患者。 图2 Western blots of glomeruli of individualswith and without diabetes. 3. 利用蛋白质组学技术研究血液循环中蛋白的表达趋势（如图3所示） 作者对于Medalist研究队列中的患者（n=180）血浆中的1129种蛋白进行了靶向蛋白质组学分析，比较了患有CKD（CKD+，n=84）组和无CKD（CKD-，n=96）组之间的差异，结果发现与CKD+组相比，CKD-组有162种蛋白明显下调和140种蛋白显著上调。同时，在这次蛋白质组分析中作者还检测到6种在前期肾小球研究中观察到差异表达的葡萄糖和TCA途径相关酶，pkm2、tpi1、ldhb和pgM1在1型和2型糖尿病患者CKD-组表达显著上调。和作者的预期一致，许多已知的标志物（如胱抑素C、β2-微球蛋白、NGA和TNFRS）均呈现下调趋势。 随后，作者讨论了重点关注的蛋白pkm2与CKD保护之间的关系。作者已经利用免疫印迹和蛋白质组学技术分别对于肾脏组织和血浆样本进行了分析，结果发现PKM2在CKD保护的个体中显著上调。多元回归分析结果发现协变量（BMI、每日胰岛素剂量、HbA1c、HDL、甘油三酯、ACR、降压药物、神经病、CVD、PDR和C肽水平）没有减弱pkm2-egfr的相关性。信号通路分析结果表明8个上调的信号通路中有4个信号通路参与了处理游离细胞内葡萄糖（戊糖磷酸、糖酵解、糖异生和丙酮酸）、轴突诱导、Notch信号通路和细胞因子-细胞因子受体互作通路的下调。 图3 Plasma proteomics among CKD-protected Medalists vs. those with CKD. 4. 利用代谢组学技术分析血液循环中关键代谢通路的表达水平（如图4所示） 作者利用代谢组学技术对CKD+组（n=57）和CKD-组（n=157）的58种血浆代谢产物进行靶向分析，结果表明与CKD+组相比，在CKD-组中32种血浆代谢产物表达下调和2种代谢物表达上调，其中丙酮酸（pkm2的代谢物）在CKD-组中表达更高，而糖酵解（葡萄糖酸盐和肌醇）、AR（山梨醇）和TCA循环（富马酸盐/马来酸盐和乌头酸盐）的代谢产物在CKD-组表达下调，进而验证了该研究团队先前的小队列分析结果。 与CKD+组相比，在CKD-组中色氨酸、葡萄糖、脂肪酸和嘌呤等类别的代谢产物表达下调，而能量代谢途径中的丙酮酸、ADP、GDP和尿苷则呈上调表达趋势。信号通路分析表明在CKD-组中4个参与葡萄糖加工的代谢产物（色氨酸、肌醇、半乳糖和酪氨酸）表达量显著下调，而丙氨酸、氨、半胱氨酸和丙酸盐代谢途径的代谢产物表达量显著上调。 图4 Plasma metabolomics among CKD-protected Medalists vs. those with CKD. 5. 蛋白质组学和代谢组学相互作用网络中重要调控节点蛋白的选择（（如图5所示） 在分别分析完蛋白质组学和代谢组学的差异蛋白质和代谢产物以及相关的信号通路后，作者开始探讨蛋白质组学和代谢组学两个层面之间的调控网络关系。通过对于重要蛋白质和代谢产物进行了网络分析的结果表明CKD-组中葡萄糖、TCA、AR和戊糖磷酸途径被激活，而与CKD+组相比，CKD-组中有3个与链接蛋白质和代谢产物的节点蛋白（APP、egfr和sgta）表达被上调。 图5 Plasma proteomics and metabolomics among CKD-protected Medalists vs. those with CKD. 6. 利用 ELISA法对于蛋白质组学结果进行验证（如图6所示） 进一步的验证是当今各种组学研究中不可缺少的重要的一环，在本文中Joslin中心的研究人员又利用ELISA法对于蛋白质组学研究结果中3种关键蛋白（TNFRsf1a、TNFRsf1b和APP）的表达量进行进一步验证。 在本文中需要验证的蛋白都是有相关的抗体可供使用，如果没有抗体的话，则可以采用基于质谱的PRM和MRM技术验证靶向蛋白的表达。
图6 Replication and validation of SOMAscan findings: TNF-a receptors and APP ELISAs. 7. 研究结论： 在1型和2型糖尿病中，参与肾小球细胞内游离葡萄糖及其代谢物的升高与肾功能的维持有关。肾脏中糖酵解酶升高和毒性葡萄糖代谢物减少的变化趋势在血液循环中也能够相同趋势的呈现， 这表明这些物质可以作为糖尿病患者内源性肾脏保护因子的生物标志物。 8. 参考文献 Gordin D, et al. Characterization of Glycolytic Enzymes and Pyruvate Kinase M2 in Type 1 and 2 Diabetic Nephropathy. Diabetes Care. 2019 Jul;42(7):1263-1273. Epub 2019 May 10. （IF=15.270） 毕业于复旦大学，在蛋白质组学、代谢组学、分子细胞生物学和生物化学领域具有15年的研究经验，具备深厚的学术和技术积累，目前已在蛋白质组学研究国际权威杂志Molecular & Cellular Proteomics、Journal of Proteome Research、Journal of Proteomics和Proteomics等杂志和肿瘤学国际权威杂志Cancer Research、Clinical Cancer Research、Cancer Letter和Cancer Science等杂志发表文章，已完成国家自然科学基金青年项目1项和省部级课题2项，目前在研国家自然科学基金面上项目2项和省部级课题2项。 毕业于同济大学，在蛋白质组学和代谢组学领域有十多年的研究经验，承接过大量的不同类型、不同物种的蛋白质组学和代谢组学服务项目，在实验设计和实施上有丰富的经验。目前已在蛋白质组学研究国际权威杂志Molecular & Cellular Proteomics、Journal of Proteomics和Proteomics等杂志和肿瘤学国际权威杂志Clinical Cancer Research、Cancer Letter和Molecular Cancer Therapeutics等杂志发表多篇文章，目前在研国家自然科学基金项目和省部级课题各1项。 2019/09/21-22（20日报到） 上海中兴和泰酒店 培训地点：上海市浦东新区科苑路866号 住宿推荐：推荐中兴和泰酒店 500元/天 费用自理（可就近预定其他酒店） 预定电话：可自行预定，或者请在报名表中注明日期和房型要求 3000元/人 ，注册费包含会场、教材、专家讲课费等费用，不含住宿费。 优惠政策： 1. 提前转账可以提前拿到学习资料。 2. 三人组团报名，每人可优惠100元每人。 3. 四人组团报名，每人可优惠200元每人。 4. 五人组团报名缴费，额外带一人免费注册。 5. 参加免注册费复听的老学员，仅需缴纳500元服务费。 6. 参加过医药加其他学习班的老学员，可优惠300元每人。 医药加科研培训中心 上海循掘生物科技中心 咨询报名：请加学习班秘书微信yiyaojia01 - END- |
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