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01 — 肿瘤微环境糖代谢 CAR-T细胞进入实体肿瘤微环境，战斗还远未结束，大量研究显示肿瘤微环境(TME)对T细胞的敌意。肿瘤细胞的糖酵解代谢使环境低氧、酸性、低营养，容易产生氧化应激。在炎症环境中，肿瘤细胞通常会上调配体，如PD-L1和Galectin-9。肿瘤微环境还依赖肿瘤相关成纤维细胞(CAS)和抑制性免疫细胞等基质细胞，包括髓源性抑制细胞(MDSCs)、肿瘤相关巨噬细胞(TAMS)、肿瘤相关中性粒细胞(TANS)、肥大细胞和调节性T细胞(Tregs)。这些细胞和肿瘤细胞分泌血管内皮生长因子(VascularEndothelialGrowthFactor，VEGF)和转化生长因子(TransformingGrowthfactorβ，TGF-β)等可溶性因子，导致肿瘤血管畸形，促进TAMS等免疫细胞的抗炎极化，并与EMT有关。它们还产生活性氧(Ros)和诸如乳酸、吲哚胺2，3-双加氧酶(Ido)、前列腺素e2(PGE2)、可溶性脂肪酸和腺苷等分子，它们有助于抑制T细胞的免疫应答。 当CAR-T激活后，从氧化磷酸化发生糖酵解，以促进更快增殖，而记忆T细胞和调节性T细胞在活化时依赖于氧化磷酸化和脂肪酸氧化（FAO）。然而，这两种代谢资源都是有限的，因为葡萄糖被肿瘤细胞耗尽，导致糖酵解T细胞营养被剥夺。缺乏葡萄糖会导致Akt/mtor信号降低、葡萄糖受体谷蛋白1下调和糖酵解能力降低。TME极限氧化磷酸化中的低氧浓度也是。总体上，这导致T细胞营养素的两个主要来源的显著耗尽。在一项来自54例透明细胞肾癌（CCRCC）患者的切除肿瘤组织的研究中，CD8TILs显示了非常低的活化和增殖水平，尽管T细胞谷氨酸仍然表达，但未吸收葡萄糖。该研究还观察到线粒体（对t细胞活化至关重要），在糖酵解过程中进行重塑，失去功能并释放有害的高浓度的ROS。这项综合研究是许多研究之一，表明低血糖对通过糖酵解和线粒体途径抑制t细胞活化的影响。 TME中的低氧状态给记忆性T细胞提供了特殊的挑战，这些细胞的代谢严重依赖于氧。最近，一些研究开始识别和测试对CAR-T细胞的修饰，以改善其在低氧条件下的功能。Kawalekar等人发现BBζCAR-T细胞比28ζCAR-T细胞具有更高的线粒体呼吸能力(SRC)，即使在缺乏营养、缺氧的条件下(如TME)，也能提高代谢效率。由于BBζ共刺激参与了促进记忆相关代谢途径，如脂肪酸氧化和增加持久性，这些T细胞中观察到的SRC增加是为了帮助他们在低氧条件下生存。 旨在保护T细胞免受氧化应激的一种方法是设计一种CAR-T细胞共同表达过氧化氢酶，这种酶可以将过氧化氢还原成水和氧气。作者在体外对CEA和HER2 CAR-T细胞进行了检测，发现与单纯CAR相比，CAR-T具有较低的氧化状态，并具有较好的增殖和细胞毒性。另一项研究利用与tme相关的低氧，开发出一种共同表达HIF1α的氧敏感结构域的CAR，这是一种在缺氧后稳定的转录因子。在体外，该策略使CAR在正常氧水平下的表达非常低，但在低氧条件下与HIF1α一起增加了CAR的表达水平。虽然这种方法并没有解决低氧或低氧的有害影响，但它确实为一种新型的安全开关提供了概念证明，该开关利用低氧疗法取得了治疗上的优势。 T细胞衰竭的特点是慢性抗原暴露，导致效应因子和记忆表型的丧失，不能产生细胞因子如干扰素γ，肿瘤坏死因子α和白细胞介素2，并上调抑制性受体的表达，从而进一步关闭效应因子与TME中抑制性配体或可溶性因子的结合。 02 — 免疫微环境中的免疫检查点 对抗T细胞衰竭最流行和最成功的策略之一是使用检查点抑制剂，针对PDL 1(Atezolizumab)、PD-1(pbrobrolizumab、nivolumab)和CTLA-4(Ipilimumab)的药物已经单独使用，并与CART细胞治疗相结合，在许多患者中取得了成功。 在临床前，结合CAR-T和检查点阻断抗体已经显示出有希望的结果。CAR-T细胞本身也被设计成分泌检查点抑制剂抗体。在人CCRCC小鼠模型中，分泌抗PD-L1抗体的抗CAIX CAR-T细胞与标准的CAR-T细胞相比表现出明显的提高活性，增加了细胞因子的产生和免疫细胞的吸收，并显着地缩小了肿瘤的大小。在另一项研究中，一种设计用于构成性分泌抗PD-1的CAR19 T细胞在CD 19肺癌异种移植模型中也显示出更强的抗肿瘤活性，其T细胞增殖和细胞毒性增强，存活时间延长。 在许多临床前研究中，IRs的显性阴性基因也被成功地引入到CAR-T细胞中，例如mesothelin CAR-T细胞(CD 28或4-1BB共刺激结构域)过度表达显性阴性PD-1。以PD-1CARs为主，观察肿瘤清除情况，重复剂量PD-1阻断抗体联合mesothelin-28ζ或mesothelin-BBζCAR均能阻止肿瘤生长，但不能根除肿瘤。近年来，CRISPR/Cas 9技术已被广泛应用于CD19-BBζt细胞的PD-1和LAG-3基因敲除。在这两种情况下，利用IR基因敲除的CAR-T细胞在小鼠异种移植模型中均根除了肿瘤。PD-1基因敲除进入临床I期(NCT03298828). 03 — 克服其他肿瘤微环境抑制因素 在临床前和临床试验中，应用细胞因子来极化肿瘤环境，使其对T细胞更具吸引力，改善CAR-T细胞的吸收和功能。局部注射IL-12可诱导炎症免疫细胞的聚集，增强过继转移的抗VEGFR-2 CAR-T细胞的抗肿瘤活性，并导致五种不同皮下肿瘤类型小鼠的长期存活。在本研究中，联合应用IL-12+VEGFR 2的CAR-T细胞，但两者均不能单独降低VEGFR 2阳性的瘤内MDSCs，为IL-12与CAR t细胞的联合应用提供了有力的支持。由于这样的阳性反应，已经建立了CAR-T细胞来增强T细胞的浸润和在实体肿瘤中的功能。CART细胞能够分泌细胞因子，称为“armored” CARs。特别是，细胞因子IL-12一直是这方面的一个有吸引力的工具。在小鼠异种卵巢癌移植模型中，MUC16 CAR/IL-12T细胞延长了存活时间，并显示出更强的持久性和肿瘤细胞毒性。最近，在一种腹膜癌病(卵巢癌转移)的同基因小鼠模型中MUC16 CAR/IL-12T细胞的输注可以延长存活时间。 其他促进TME细胞功能的策略包括抑制诸如腺苷、IDO 1和VEGF等抑制性可溶性因子，以及保护TME中的非肿瘤细胞(如MDSCs、TAMS和基质细胞)免受免疫抑制。在一项在同基因肿瘤模型中使用HER2 CAR-T细胞的研究中，阻断腺苷2a受体通过增强激活和促进细胞因子的产生，显著提高了CAR-T细胞的疗效。此外，作者还报道了PD-1的阻断进一步增强了T细胞的免疫应答.另一项研究表明，阻断IDO1(与结肠癌患者生存呈负相关)与EGFRvIII CART细胞转移相结合，可显著减缓异种移植结肠癌模型中的肿瘤生长。VEGF阻断治疗黑色素瘤等实体瘤已取得成功，VEGF靶向CARs在多种临床前实体瘤模型中显示出疗效。 增加抗肿瘤反应也可能包括耗尽抗炎细胞或在其他免疫细胞中诱导更多的炎症表型。对小鼠乳腺癌模型的研究表明，靶向TAMs可能对治疗进展性癌症有效，因为TAMs与更多的抗炎活性和肿瘤免疫逃避有关。另一项研究表明，在小鼠卵巢癌模型中，巨噬细胞与VEGF阻断有关。当巨噬细胞耗尽，存活时间延长，而巨噬细胞缺乏的小鼠，除非巨噬细胞重新进入肿瘤，否则就不会出现抵抗力。因此，TAMs是一种高度活跃的免疫细胞亚群，似乎能促进肿瘤的存活和免疫逃避。在卵巢癌的皮下小鼠模型中，HER2 CAR-T细胞的肿瘤排斥反应要求基质细胞上存在M1(炎性)巨噬细胞和干扰素γ受体，这表明T细胞，甚至功能性细胞的肿瘤特异性攻击可能不足以清除肿瘤；基质细胞靶向(例如用FAP CARS)和招募其他类型的炎症免疫细胞可能是必要的。消耗MDSCs也可以改善T细胞的反应，如GD2 CAR的一项研究所示，在异种移植肉瘤模型中，仅CAR-T细胞没有抗肿瘤活性，但与使用全反式维甲酸减少MDSC相结合，可产生显著的抗肿瘤活性。诺曼等人在体内证明，TME中的缺氧在MDSCs上PDL-1的上调及其随后的TILS抑制中起着重要作用。PDL-1的上调依赖于HIF1α，PDL-1阻断可阻止MDSCs对T细胞的抑制作用.在另一项研究中，使用CEA CAR，阻断PD-l1阳性MDSCs和tme增强的CAR-Tt细胞抗肿瘤功能中的Tregs。 主要参考文献 Marina Martinez，Frontiers in Immunology（2018） 一个纯粹的免疫学交流空间 喵语一则 人生在世，不是所有的话都非说不可。 有些话，不必说，因为该懂的人自然会懂； 有些话，不能说，因为做人总要保有最基本的尊重； 有些话，不想说，因为万般皆苦，唯有自渡。 留恋戏蝶时时舞--摄于茂兰国家级自然保护区 |
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