肝癌免疫微环境:肝细胞癌的治疗意义

肝癌是全球第六大常见癌症，也是癌症相关死亡的第四大原因，其5年生存率为18%。肝细胞癌(HCC)占90%。乙型肝炎病毒(HBV)感染是主要危险因素，占50%。其他病因包括丙型肝炎病毒(HCV)感染、长期饮酒和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。尽管疫苗(针对HBV)和最近的抗病毒治疗(针对HCV)降低了病毒性HCC的发病率，但HCC的发病率仍在增长，主要原因是在西方国家酗酒和肥胖/糖尿病。HCC的病理生理学是一个复杂的多步骤过程，具有异质性的突变景观和组织学特征。TERT启动子突变/重排诱导的端粒酶激活见于80%的HCC。二代测序能够鉴定HCC中的候选癌症驱动基因，如TP53(28-36%)、CTNNB1(17-37%)、AXIN1(4-14%)、ARID1A(16.8%)和ARID2(5.6%)，影响细胞周期控制、Wnt/β-catenin通路和表观遗传机制。

目前，只有25%的HCC患者至少有一个潜在的可作为治疗靶点的突变，而主要的癌症驱动基因仍然无法用药。不幸的是，HCC对经典的化疗无效，肝切除和肝移植是主要的治愈性治疗。自2010年以来，基于酪氨酸激酶抑制剂(TKI)的全身性治疗改善了患者结局。索拉非尼通过血管内皮生长因子受体2 (VEGFR2)靶向RAF-MEK-ERK级联反应和血管生成，并被用作一线治疗，但与安慰剂相比仅带来2.8个月的生存获益。2018年，REFLECT 3期研究报告了仑伐替尼的疗效，仑伐替尼是另一种对VEGF-受体和FGFR家族具有更强活性的TKI，与索拉非尼相比，仑伐替尼的中位总生存期略有延长(13.6个月vs 12.3个月)。晚期HCC的二线治疗方案包括其他TKI(瑞戈非尼和卡博替尼)和雷莫芦单抗(ramucirumab)，雷莫芦单抗是一种特异性VEGFR2的单克隆抗体，它对索拉非尼治疗失败后血清AFP浓度高的患者显示出特异性获益(REACH研究)。

自2017年以来，调节肝脏肿瘤微环境的其他疗法相继出现。帕博利珠单抗和纳武利尤单抗是两种靶向程序性细胞死亡受体-1 (PD-1)的免疫检查点抑制剂(ICI)，已被FDA批准用于晚期HCC的二线治疗(它们未能证明在总生存期方面显著优于索拉非尼)。纳武利尤单抗联合伊匹单抗(一种靶向细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4 [CTLA-4]的单克隆抗体)已被FDA批准用于晚期HCC的二线治疗。2020年，在3期IMBRAVE-150研究(NCT03434379)中，阿替利珠单抗(抗PD - L1)和贝伐珠单抗(抗VEGF)联合治疗显示出优于索拉非尼的优势(中位无进展生存期为6.8个月，而索拉非尼为4.3个月)，之后FDA批准阿替利珠单抗(抗PD - L1)和贝伐珠单抗(抗VEGF)联合治疗用于晚期HCC的一线治疗。然而，尽管有这些前所未有的和令人鼓舞的结果，只有20-30%的患者对免疫疗法有应答，到目前为止，生物标志物未能清楚地阐明有应答的人群。综上所述，我们迫切需要更好地表征肝癌微环境，以便设计新的联合疗法，以抑制肿瘤发生和/或恢复对免疫治疗耐药肿瘤的敏感性。此外，识别应答和耐药的生物标志物将改善患者个性化治疗的选择。

本文就肝脏肿瘤微环境(TME)在肝癌发生发展中的作用作一综述。此外，我们总结了目前关于髓系细胞和淋巴细胞的可行治疗方法、新疗法和目前的临床试验。虽然血小板现在被认为是HCC和HCC肿瘤微环境的重要调节因子，但考虑到血小板的独特性质(它们是缺乏细胞核的巨核细胞碎片)，它们在其他文章中进行了综述。

肝脏免疫微环境

肝脏含有大量免疫细胞:中性粒细胞、单核细胞、常驻巨噬细胞(Kupffer细胞，KC)、自然杀伤细胞(NK)、自然杀伤T细胞(NKT)以及肝脏转运和/或常驻淋巴细胞(B、CD8 T、CD4 T和γδ T细胞)(图1)。肝脏环境对肠道来源的微生物代谢物具有高度耐受性，以维持整体稳态。这种免疫耐受是由于肝脏常驻细胞(肝细胞、内皮细胞、KC和树突状细胞/DCs)和外周血白细胞之间在没有共刺激分子的情况下持续的抗原提呈，使KC来源的IL-10诱导的调节性T细胞(Treg)扩增成为可能。抗炎细胞因子(IL-10、IL-13和TGF-β)和促炎细胞因子(IL-2、IL-7、IL-12、IL-15和IFN-γ)之间存在总体平衡，维持着体内稳态。

 慢性肝病导致炎症信号上调，并引起与坏死性炎症相关的稳态失衡。在慢性HBV感染期间，循环中的HBV或HBV衍生抗原的载量促进T细胞的失活(耗竭)和随后的死亡，这与整体免疫功能的减弱相关。由于HCV的高突变率和病毒因子对抗DNA感受器，HCV避免了免疫系统的识别。另一方面，长期饮酒和NAFLD的特征是无菌性炎症，可放大促炎信号，并激活单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞。近十年来，免疫细胞参与慢性肝损伤(CLD)的研究不断深入，并显示出其在支持疾病进展中的关键作用。此外，越来越多的证据表明肠道通透性、微生物组和微生物代谢物在CLD和HCC中发挥作用。最近，一项离体研究表明，来自NAFLD-HCC患者的细菌提取物可诱导T细胞免疫抑制环境，同时减少细胞毒性T细胞。靶向肠道-微生物-肝轴代表了一个令人兴奋的临床机会;然而，我们需要开展更多工作来从临床和功能上验证以微生物组为靶点的治疗潜力。

 大多数HCC是在这种慢性免疫抑制性坏死-炎症环境中演变的。与免疫检查点分子增加相关的T细胞共刺激因子减少导致T细胞效应功能受损。在癌症，尤其是HCC中，TME促进癌细胞的生长，并为癌细胞形成一个安全的生态位，以抵消免疫系统的激活。此外，HCC肿瘤呈现中间突变负荷和许多不同的免疫逃避机制。最近基于单细胞RNA测序(scRNAseq)的研究表明，HCC细胞表现出高度的患者间变异性，而TME显示出在患者之间更一致的重复基因表达标签。这些结果提示靶向TME的策略，如免疫治疗，可能对HCC患者更有效。

中性粒细胞:朋友还是敌人?

中性粒细胞是固有免疫细胞，在感染、损伤或肿瘤发生过程中，它是最早浸润组织的细胞之一。在一些实体人类肿瘤中，肿瘤相关中性粒细胞(TANs)的高浸润水平已被证明与肿瘤生长、淋巴结转移和不良预后相关。然而，TAN有两种不同的类型:抗肿瘤(N1)或促肿瘤(N2) 。促肿瘤N2 TAN具有形成嵌有颗粒状蛋白质的解压缩染色质的能力，称为中性粒细胞胞外诱捕网(NETs)，已知支持肿瘤生长 。在HCC中，肿瘤周围区域富集的CD66b 中性粒细胞与总生存率下降相关(n=149)。

多项研究强调了肿瘤细胞、TANs和癌症相关成纤维细胞(CAFs)之间的交互作用在影响HCC进展中的重要性。CAFs可通过SDF1a/CXCR4/IL-6通路抑制中性粒细胞功能，诱导CD66b、PD-L1、CXCL8/IL-8、TNF和CCL2的表达，从而抑制T细胞的功能和增殖。CAFs分泌的心肌营养素样细胞因子因子1 (CLCF1)可介导CXCL6和TGF-β的肿瘤表达，分别负责中性粒细胞募集和“N2”极化。在人肝癌中，TANs在肿瘤进展的中晚期获得了与CLCF1水平升高相关的肿瘤前N2表型。事实上，CLCF1可能是HCC的潜在预后生物标志物，选择性阻断CLCF1信号通路可能是HCC患者的有效治疗(图2)。

N2 TAN可以诱导肝癌细胞的干细胞样表型。TANs与肝癌细胞系共培养增强了肝癌细胞的增殖、侵袭和死亡逃逸等致瘤特性。将HCC细胞和TANs注射到NOD-SCID小鼠(B细胞和T细胞缺陷)中，与单独的HCC细胞相比，促进了HCC的生长。在机制上，TANs分泌骨形态发生蛋白2 (BMP2)和TGF-β2，导致癌细胞中miR-301b-3p的表达，这增加了干细胞特性和CXCL5 -中性粒细胞趋化因子作为正反馈环。在三个队列的HCC患者(n=919)中进行的多变量分析表明，CXCL5过表达，单独或联合瘤内中性粒细胞存在，是总体生存的独立预后指标。HCC肿瘤的CXCL5分泌是由TGF-β和AXL途径诱导的，这表明靶向这些途径可能是对抗TGF-β阳性患者HCC进展的有效治疗策略。这些研究表明，抑制CXCL5可能是减少TAN浸润的潜在治疗靶点，可以与肿瘤靶向治疗相结合。有趣的是，索拉非尼治疗通过HIF1a/NF-kB/CXCL5通路增加TAN在动物模型和HCC患者(n=46)中的浸润，并通过抑制凋亡促进其生存。在荷瘤小鼠中，TANs通过分泌CCL2和CCL17招募巨噬细胞和Treg细胞诱导索拉非尼耐药。事实上，具有低水平CCL2 或CCL17 细胞的人HCC肿瘤有较长的生存期。在荷瘤小鼠中使用抗Ly6G抗体去除TAN后，与索拉非尼联合使用时，肿瘤生长和新生血管的抑制程度比单独使用索拉非尼更大。在荷瘤小鼠中使用抗Gr1抗体去除TANs减少了侵袭性肿瘤边缘的肿瘤大小和微血管密度 (图2)。

N2 TAN还具有形成NETs的能力，NETs可在NAFLD期间促进HCC的发展。在STAM小鼠模型(新生期链脲佐菌素和高脂饮食诱导的NAFLD)中，通过DNase处理抑制NET形成不影响脂肪肝的发展，但减少了肿瘤的生长，主要是通过降低IL-6水平。NETs通过调节氧化磷酸化途径(OXPHOS)促进CD4 T细胞分化为Treg，从而将固有免疫和适应性免疫联系起来 。此外，在晚期HCC阶段，NETs可以通过激活TLR4/9-COX2促进炎症反应来促进侵袭 。体内应用抗炎药物(阿司匹林)和DNAse I阻断COX2及其上游通路，可有效抑制肝癌转移。此外，通过抑制组织蛋白酶G (NETosis过程中释放的一种丝氨酸蛋白酶)来阻断NETs，可以在体外阻止癌细胞的侵袭，并减少小鼠的肺转移 。有转移的肝癌患者癌旁组织中cathepsin G蛋白密度高于无转移的肝癌患者。这些发现提示NASH-HCC和HCC晚期存在NETs，提示消除NETs可能会减少肝癌的发生或进展(图2)。

 TANs还可以释放许多免疫调节和血管生成因子，从而操纵TME或影响癌细胞。多项研究提供的证据表明，血中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)升高与HCC患者的不良结局相关。改变TAN的募集、迁移或激活可能是一种有趣的治疗策略，但临床试验中明显缺乏这一策略。仑伐替尼通过诱导TME中CXCL2和CXCL5的分泌并迫使其向N2表型极化来增加TAN募集，这一发现支持了这一观点。然而，仑伐替尼与COX-2抑制剂塞来昔布联用减少了体内NET浸润，并且使T细胞发生PD-1耗竭。此外，TGF-β通路具有促进N2 TANs的能力，但在多个信号通路中也具有多效性作用，可以直接干预肿瘤的发展，促进肿瘤进展并驱动癌细胞的免疫逃逸。在HCC中，TGF-β通常发挥双重作用，在早期发挥肿瘤抑制作用，在晚期促进肿瘤进展。一些靶向TGF-β及其受体的临床试验正在肝癌患者中进行。Galunisertib/ LY2157299是一种新型TGF-β受体1激酶抑制剂，目前正在进行2期试验，研究其与纳武利尤单抗(NCT02423343)、索拉非尼或雷莫芦单抗(ramucirumab) (NCT02240433、NCT02178358和NCT01246986)联用。  

单核细胞: Dr Jekyll 还是Mr Hide?( Jekyll and Hyde是英国作家Stevenson的作品，是一部脍炙人口的经典小说。书中的主角是善良的医生Jekyll，他将自己当作实验对象，结果却导致人格分裂，变成夜晚会转为邪恶Hyde的双重人格，最后Jekyll以自己的自尽，来停止hyde的作恶。)

 单核细胞是一种固有免疫细胞，在肿瘤中发挥着双重作用。它们经常通过肿瘤CCL2的产生被募集到肿瘤中。在肝癌中，不同的单核细胞亚群在肿瘤形成过程中被表征。在早期阶段，募集的单核细胞能够杀伤肿瘤细胞;然而，逃避免疫监视的肿瘤通过将单核细胞重编程为免疫抑制细胞来阻碍单核细胞诱导的死亡。这已经在移植了人肝癌细胞系的人源化小鼠模型中得到了证明，在该模型中，注射来自早期肝癌患者的CD14 单核细胞能够杀死移植的HepG2细胞。然而，来自同一患者进展至晚期后的CD14 单核细胞缺乏抗肿瘤活性，并表达PD-L1/2，这抵消了CD8 T细胞对HepG2和Huh7细胞的抗肿瘤活性。PD-L1/2 CD14 单核细胞患者的总生存期较其他CD14 细胞患者短(n=87)。这些PD-L1/2 CD14 单核细胞也表达免疫抑制细胞因子，如IL-10和CCL1。受肿瘤影响的CCR1 CD14 单核细胞表达PD-L1, B7-H3和TIM-3，并上调耐受性代谢酶，促进血管生成和转移 。通过对HCC细胞系和组织中趋化因子表达的分析，发现CCL15是CCR1 CD14 亚群在肿瘤浸润边缘的主要招募者(72例)，并且在两组患者(n=360和n=253)中，CCL15高表达的患者预后较差。阻断CCL15-CCR1轴显著抑制体内原位肿瘤生长和肺转移，可能是一种有趣的临床策略，以避免CCR1 CD14 单核细胞的募集。重要的是，CCL15可在血液中测定，并可作为生物标志物 (图3)。

 另一种治疗方案可能是通过抑制必需代谢酶来避免产生致瘤性单核细胞。据报道，肿瘤周围CD86 HLA-DR 单核细胞的糖酵解开关可调节HCC患者的TME。机制上，PFKFB3糖酵解酶在单核细胞代谢转换过程中被诱导，从而导致PD-L1表达，从而促进人HCC中CD8 T细胞失活、免疫逃避和疾病进展。同样的单核细胞群也可以通过CXCL2/CXCL8在肿瘤内募集中性粒细胞，这反过来产生有利于疾病进展的促转移因子制瘤素M (图3)。研究发现制瘤素M的水平与HCC患者的转移呈正相关。

髓源性抑制细胞(MDSC)是一种异质性髓系细胞亚群，已被证明在癌症和HCC中可抑制T细胞应答。MDSC有两个不同的群体:单核细胞型(M-MDSC-CD14 )和多形核型(PMN-MDSC-CD11b CD33 HLA-DR -)。两者分别与单核细胞和中性粒细胞具有相同的表型和形态特征 。在HCC患者(77例)的外周血(n=111)和肿瘤(n=12)中观察到特异性M-MDSC亚群的增加。在体外共培养过程中，该群体能够诱导CD4 CD25 Foxp3 Tregs并通过NKp30依赖的细胞接触抑制自体NK细胞的细胞毒性。在表达致癌细胞周期相关激酶(CCRK)的肿瘤中，MDSC在HCC患者的肿瘤和血液中聚集，CCRK/IL-6/CD11b/CD33高表达与最差的预后相关。临床前肝癌小鼠模型表明，CCRK信号通路通过招募MDSCs来协调免疫抑制性TME的建立，而这一过程可通过靶向CCRK或IL-6来抵消。肝星状细胞(HSCs)也可以通过CD44依赖的接触和未知的伴侣，从循环的CD14 HLA-DR高单核细胞诱导M- MDSCs。在一组患者中(n=31)， CD33 CD-11b - MDSCs富集于肿瘤周围的纤维化肝脏。作者还发现在人HSC-PBMC共培养系统中，活化的HSC细胞释放因子激活单核细胞-内源性p38信号，导致M-MDSC特异性基因表达。MDSCs中p38的活化是募集C/EBPβ和p300到染色质的必要条件，从而促进H3K27乙酰化和BRD4在增强子上的结合。在HCC患者来源的PBMCs中，用i-BET762阻断增强子导致M-MDSC减少。此外，i-BET和抗PD-L1通过减少M-MDSC和增加CD8 T细胞来提高抗肿瘤活性，从而提高了CCL4诱导的纤维化HCC模型的长期生存率。小鼠对这一联合治疗的耐受性良好，可能代表了一种新兴的患者治疗策略。i-BET762 (Molibresib/GSK525762)目前正在进行1 / 2期临床试验(NCT02964507/NCT03150056)，用于治疗晚期或转移性乳腺癌和去势抵抗性前列腺癌(图3)。单核细胞谱可能为HCC提供诊断或预后标志物。此外，针对单核细胞募集或分化的治疗方法的开发可能是改变中性粒细胞募集和CD8 T细胞抑制的有趣方式。

巨噬细胞:坚韧的细胞

 在稳态中，单核细胞来源的细胞发育为肝脏DCs或巨噬细胞。此外，肝脏中存在巨噬细胞库，即库普弗细胞(Kupffer cell)，它来源于胚胎发生期间的卵黄囊来源的前体细胞。库普弗细胞被危险信号激活，然后通过诱导包括单核细胞在内的免疫细胞募集来促进肝脏慢性炎症。根据环境刺激的不同，巨噬细胞可分为M1和M2两种主要亚型。M1型巨噬细胞由微生物成分或促炎细胞因子(TNF、IFN-γ、TLR)诱导，通过释放一氧化氮、活性氧以及促炎细胞因子IL-1、IL-6、IL-12、TNF-α、CXCL5和CXCL8/10发挥促炎功能。而M2型巨噬细胞在IL-4、IL-10、IL-13和糖皮质激素的作用下极化，发挥免疫抑制功能，促进组织修复。CD68标志物是肝脏肿瘤相关巨噬细胞(TAM)定位和分布的常用标志物，而CD86 (M1)、CD163 (M2)和CD206 (M2)的表达水平在体外被接受来区分M1和M2型巨噬细胞。然而，M1/M2的命名存在争议，因为存在许多不同的极化表型，这些表型在组织中可见，并由许多不同的刺激驱动。在M2亚型中，根据其激活刺激，有几个亚型(M2a, M2b, M2c和M2d)。然而，由于这些亚类具有广谱的激活状态和标记物，因此很难在体内识别。

巨噬细胞是HCC TME的主要组成部分，并具有多种促肿瘤作用，包括免疫抑制、转移、血管生成、维持癌细胞干性和耐药。不同的研究报道，高水平的TAMs，尤其是在癌旁区域，与HCC患者的不良预后相关。肿瘤内或边缘部位的TAM高浸润也可预测肿瘤切除术后的不良预后。对肝硬化HBV阳性患者队列(n=137)中CD68 -TAMs的分析表明，边缘巨噬细胞密度与血管侵犯、肿瘤多发和纤维包膜形成相关。此外，在HBV 相关的肝硬化/HCC队列(n=253)中，CD206 M2巨噬细胞失衡与肿瘤-淋巴结-转移分期较晚、总生存期较差和复发时间较短的侵袭性表型相关。在一个小队列的患者中(n=26)， TAMs的密度也与经动脉化疗栓塞的抵抗相关。因此，靶向TAMs的免疫疗法已成为治疗HCC患者的一种有前景的方法，可分为不同的机制，包括抑制单核细胞募集、消除肿瘤组织中预先存在的TAMs、重塑TAM极化、促进吞噬作用和中和TAMs分泌的促肿瘤因子(图4)。

 一些研究已经探讨了HCC中单核细胞募集和TAM蓄积的机制。HCC细胞中发生的线粒体分裂与CD163 -TAMs的浸润相关(n=69)。事实上，分裂诱导肝癌细胞胞浆线粒体DNA，激活TLR9/NF-κB通路，进而增加CCL2的产生，TAM的化学吸引。阻断CCL2/CCR2信号通路似乎可以抑制单核细胞/TAM募集和M2极化，从而激活抗肿瘤CD8 T细胞应答。此外，CCL2在人肝癌中高表达，并与不良预后相关。纳武利尤单抗(抗PD1)联合CCR2 /5抑制剂目前正在进行2期临床试验(NCT04123379)。骨桥蛋白/CSF1/CSF1R通路是导致TAMs积累和ICI失败的另一个因素。在人肝癌肿瘤中，骨桥蛋白表达与PD-L1表达以及TAM浸润呈正相关。在一些肝癌小鼠模型中，骨桥蛋白通过激活CSF1受体促进肝癌细胞的趋化迁移和M2极化，并促进PD- L1的表达。因此，CSF1/CSF1R阻断可能通过劫持TAMs来增强抗PD-1/L1免疫治疗的疗效。CSF-1R抑制剂PLX3397能够抑制荷瘤小鼠的肿瘤生长，促进向M1表型的极化转移，MDSCs的减少，肿瘤中的CD4 T细胞与CD8 T细胞数量的增加相平衡。目前，一项1期研究正在包括HCC在内的晚期实体瘤患者中测试MET/CSF1R/SRC抑制剂(TPX-0022) (NCT03993873)(图4)。

 抑制TAMs是治疗HCC的潜在策略。索拉非尼与TAM清除剂(氯滴立或唑来膦酸)联用可诱导抗转移和抗血管生成作用。有趣的是，索拉非尼治疗导致血液和肿瘤内F4/80和CD11b阳性细胞的出现率较高。在裸鼠肝癌模型中，索拉非尼诱导肿瘤坏死与HNF-1α分泌和TAMs趋化有关。联合抗巨噬细胞药物可降低VEGF，增强对肿瘤生长和肺转移的抑制作用。此外，索拉非尼和唑来膦酸联合使用可以协同降低肿瘤中CXCR4 的血管密度。事实上，在经TACE和唑来膦酸治疗的大鼠肝癌模型中也观察到了类似的临床前观察结果。有趣的是，唑来膦酸已被广泛应用于多种癌症中，通过抑制破骨细胞活性来预防骨转移和减少骨骼肿瘤负荷，并且在患者中具有良好的耐受性。

对TAMs的补救可能是治疗HCC的一种潜在的替代策略。事实上，肝癌细胞分泌的miR-146a-5p包埋外泌体可以培养巨噬细胞并促进M2极化，从而产生促肿瘤效应，尤其是通过诱导PD-L1上调和T细胞耗尽。最近，细胞外囊泡通过激活糖酵解在单核细胞分化中发挥作用。由单核细胞系THP-1分化而来的M2型巨噬细胞通过HGF/c-Met信号通路在体外诱导肝癌对索拉非尼耐药。HGF还增加了单核细胞从血液中的募集，形成了一个前馈循环。在荷瘤小鼠中，M2型TAMs在索拉非尼耐药肿瘤中比索拉非尼敏感肿瘤中聚集更多，并产生大量HGF。这些新见解为cMET/HGF抑制剂(卡博替尼或特泊替尼)单独或联合使用以提高全身性治疗疗效提供了理论基础。特泊替尼目前处于用于晚期HCC患者的Ib/2期试验，而卡博替尼联合阿替利珠单抗用于晚期HCC患者的III期临床试验正在进行中(NCT02115373- NCT03755791)。TAM向M1样表型的极化也可以被IFN-α诱导，并且在原位肝癌种植模型中与索拉非尼有协同作用，抑制肝癌的生长和转移。另一种策略可能是通过疫苗将TAM极化从M2倾斜到M1，在荷瘤小鼠模型中，疫苗已显示出与抗PD-1免疫治疗的协同抗肿瘤效应。

中和TAMs分泌的促肿瘤因子是另一种可能的策略。HCC患者血清中IL-6的升高与HCC单核细胞和巨噬细胞中PD-L1的表达有关。值得注意的是，IL-6的表达与干性和肿瘤进展相关，这种细胞因子可以由TAMs和MDSCs产生。托珠单抗是FDA批准的用于治疗类风湿关节炎的人源化抗IL6受体抗体，能够抑制肝肿瘤的发生。有趣的是，一项招募患者的临床试验(NCT04524871)将尝试在晚期肝癌患者中评估基于免疫疗法的多种联合治疗(阿替利珠单抗、贝伐珠单抗和托珠单抗)的疗效和安全性。抗IL-6抗体司妥昔单抗(siltuximab)可能是另一种方法，因为FDA已批准其用于特发性多中心卡斯尔曼病。

最近，通过结合人类胎肝和HCC (n=14)的单细胞图谱，一种新的TAM亚群被发现可以分泌VEGF并促进TME和HCC严重程度的癌胎重编程。这些胎肝相关CD163 -TAMs能够通过免疫检查点受体和其他配体(CD40LG/CD40、CD28/CD86、SIRPA/CD47和CD86/CTLA4)与免疫细胞相互作用。有趣的是，VEGF通路以不同的方式促进免疫抑制，包括抑制抗原呈递细胞和激活抑制性MDSCs、TAMs和Treg细胞，这为ICI与抗血管生成药物联合应用提供了理论基础。IMBrave150 HCC临床试验(NCT03434379)联合了VEGF抑制剂贝伐珠单抗和阿替利珠单抗，最近显示出与索拉非尼单药治疗相比结局改善，因此获得了FDA批准。通过抑制免疫抑制细胞，增加DC成熟和细胞毒性T细胞活性，VEGF抑制剂可以允许从冷肿瘤转变为热肿瘤。然而，大剂量或长期使用抗VEGF药物治疗可能导致血管过度减少并促进缺氧，这凸显了使用抗VEGF治疗的挑战。值得注意的是，瑞戈非尼和索拉非尼具有相似的靶点，但瑞戈非尼具有更强的抗血管生成作用。

巨噬细胞和TAMs在HCC中的作用是一把双刃剑，因为这些细胞同时具有抗肿瘤和促肿瘤功能。针对这些人群或通过强迫表型转换对他们进行重新补救可能代表了一种潜在的治疗方法。此外，提高巨噬细胞的吞噬能力可以降低其他实体癌的肿瘤负荷。

树突状细胞使T细胞滚动

树突状细胞(DC)是连接固有免疫和适应性免疫的重要环节，它协调抗原呈递，导致T细胞的活化和分化。与巨噬细胞相比，DCs具有迁移特性，并在组织引流淋巴结中将抗原提呈给T细胞;然而，许多DC - T细胞之间的相互作用也发生在肝脏。CD8 T细胞的激活依赖于CD4 辅助性T (Th)细胞之前对DC的激活。一个完全功能的免疫突触由三个受调控的步骤定义。首先DC必须将MHCⅡ类分子上的抗原提呈给CD4 辅助性T细胞，将MHCⅠ类分子上的抗原提呈给CD8 T细胞。其次，免疫球蛋白超家族(CD80-CD86/CD28)和TNF超家族(CD40L/CD40、4-1BBL/4-1BB、CD27/CD70、CD30L/CD30和HVEM/LIGHT)的共刺激分子必须发生相互作用，从而触发刺激CD8 T细胞扩增和分化的细胞因子的产生(第三步)，如IL- 12和Ⅰ型IFN(图5A)。CD8 T细胞许可可由CD4 辅助性T细胞(“经典许可”)或NKT细胞(“替代许可”)促进。这三个步骤中的任何一个受到干扰都会导致适应性反应功能失调。因此，癌细胞逃避免疫监视的主要机制之一是破坏这种免疫突触，通常是通过表达抑制性配体来阻止T细胞活化T细胞耗竭的定义为T细胞增殖和分泌细胞因子的能力受损，可通过抑制性免疫检查点受体(如PD1、CTLA4;LAG3 lymphocyte-activating 3;甲型肝炎病毒细胞受体2 (TIM3)。如前所述，抑制性免疫检查点配体不仅在HCC肿瘤细胞中表达，而且在髓系细胞(如DCs、TAMs和中性粒细胞)中也有表达。

DC群体的异质性取决于其发育谱系、分化阶段和生理病理微环境。它们通常分为:传统树突状细胞(cDC)、浆细胞样树突状细胞(pDC;CD303 CD304 ，分泌I型IFN)和炎症DCs (infDCs, SIGN ，在慢性炎症环境中从单核细胞分化而来，诱导辅助性T细胞(Th)-17分化)。cDCs又称髓系DCs，可进一步分为CD141 /CD14 ^- 1型cDCs (cDC1)和CD1c /CD14 ^- 2型cDCs (cDC2)。

在HCC患者的外周血中，与健康对照相比，一些研究观察到循环pDC和cDC的减少，以及这些DCs上共刺激分子的表达降低，与IL-10浓度呈负相关。在3组患者(n=1065)中，发现CD303 pDC在人HCC肿瘤中聚集(n=39)，并与1型Treg (P3 - CD49 LAG-3 )定位相关，并与不良预后相关。事实上，肿瘤内大量的BDCA2 pDCs与甲胎蛋白(AFP)水平高、肿瘤-淋巴结-转移分期高以及Treg和IL-17产生细胞的肿瘤浸润增加相关。在体外，pDCs能够通过ICOS- l /ICOS相互作用，从初始CD4 T细胞诱导出1型Treg (Tr1)，从而产生Tr1型IL-10(图5B)。此外，在人肝癌(n=59中，肿瘤cDC表达抑制性配体，如PD-L1, Gal9 (TIM3的配体)，MHC-II (LAG3)， CD86和CD80 (CTLA4)。scRNAseq目前正在帮助发现新的突出DC异质性的DC子集和标志物。在一个小的肝癌患者队列中(n=18)，与133个PBMC DC相比，肿瘤DC表达高水平的MHC-II分子，但低水平的MHC-I分子。cDC1和cDC2被区分出来，但只有cDC2聚集在肿瘤中，并且可能能够将特异性抗原提呈给CD4 T细胞。此外，在HCC患者中发现了一个新的cDC分类(cDC3)，其表达CCL19、LAMP3和CCR7。最近，scRNAseq在16例未经治疗的肝癌患者的肿瘤中发现了三个在肿瘤中富集的DC亚群:DC-c1- CD1C, DC-c3- CLEC9A和DC-c4- LAMP3。在HCC核心富集的DC-c4 LAMP3 亚群表达成熟和迁移标志物(LAMP3, CD80, CD83, CCR7)，但也表达PD-L1/2，预测可结合并抑制PD-1 T细胞。对肝HCC TCGA数据的分析表明，LAMP3 DC标签与T细胞的耗竭/调节之间有强相关性(图5B)。

增强DC/CD8 T细胞对话的策略已被开发，如过继免疫疗法和基于DC的疫苗，试图恢复有效的抗肿瘤反应。对临床试验进行的一项荟萃分析(n= 1,276例患者，19项试验)强调，基DC的免疫疗法获得了更好的结局，提高了CD4 T/CD8 T比值，并且对患者是安全的。由链球菌来源的抗癌免疫治疗药物(OK432)产生的DC -OK432能够产生大量的Th1细胞因子(IL-12和IFN- γ)，并通过CD40/CD40L相互作用增强细胞毒性T细胞的活性。这DC -OK432可以从获取的患者单核细胞中产生，先用IL-4和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激，然后用OK432刺激。13例肝细胞癌患者在经导管肝动脉栓塞术中应用DCs-OK432后无复发生存期延长。

以DC为基础的疫苗接种是另一种治疗方法，其基础是在体外将单核细胞来源的DC暴露于肿瘤抗原(肿瘤裂解物或肿瘤相关抗原- TAAs)，并伴随刺激信号(GM-CSF, IL-4, TNF-α)，当引入患者体内时触发抗肿瘤反应。几年前，尽管DC疫苗具有安全性和耐受性，但未能改善HCC患者的结局。然而，AFP负载DC能够刺激特异性的细胞毒性T淋巴细胞对AFP产生的肝癌细胞进行杀伤。最近，DC疫苗与ICI的联合应用显示出了有希望的结果。在预先建立的体内皮下和原位肝癌中，AFP-DCs单独诱导肿瘤生长显著降低和轻微延迟，而AFP-DCs和表达CD40l的DCs联合具有协同作用，与Th1细胞因子水平增加，细胞毒性T淋巴细胞浸润和肿瘤凋亡相关。此外，DC疫苗联合PD-1抑制剂治疗的原位肝癌小鼠模型显示出比单药治疗更长的总生存期，并通过诱导凋亡使肿瘤体积更大的缩小。来自临床试验的数据表明，最有希望的策略是与ICI的联合，可能代表了黑色素瘤和前列腺癌的潜在治疗。

对包含3,756例患者的22项研究进行的一项荟萃分析报告，细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的DC免疫疗法联合各种标准治疗可改善患者预后。DC-CIK疗法是指来源于患者的单个核细胞经活化、扩增、修饰后介导CIK活化，主要为CD3 CD56 Ⅱ型杀伤T淋巴细胞(NKTs)。DC-CIK疗法最近在一个小队列的HCC患者中进行了研究(n=36)，其中负载CD24(癌症干细胞的标志物)的DC细胞能够降低血清Treg浓度，并导致CD3 、CD4 和CD56 标志物的增加，并改善生存。本研究强调了DC-CIK疗法可以改变免疫平衡，在长期控制肿瘤进展方面具有潜在的治疗获益。

DC介导的抗原交叉呈递功能障碍和随后的T细胞抑制是肿瘤免疫逃逸的核心机制。过继性DC免疫疗法和基于DC的疫苗是增强DC/T细胞对话和恢复高效抗肿瘤应答HCC的有前景的免疫策略(图5B)。然而，需要强调的是，这些疗法是基于DCs的最佳成熟状态、肿瘤抗原的选择、剂量和给药途径。

NK细胞进行杀伤

NK细胞是一种颗粒状的CD3 -淋巴细胞群，可触发针对病原体和恶性细胞的直接固有免疫反应。它们约占人外周血淋巴细胞的10%，并细分为两个主要群体:免疫调节剂(CD56 bright /CD16 -)亚群和细胞毒性(CD56 dim /CD16 )亚群。NK细胞表达抑制性受体，如抑制性杀伤免疫球蛋白样受体(iKIRs)和c型凝集素样受体NKG2A，分别结合MHC-I和非经典MHC-I复合物HLA-E。细胞上缺乏这些配体会与活化的NK受体(NKp30、NKp46、NKp44、NKG2D和NKG2C)结合，这些受体与感染或肿瘤转化细胞上表达的假定配体结合 (图6A)。外周血NK细胞的高细胞毒活性与癌症风险降低呈正相关。树突状细胞在NK细胞介导的抗肿瘤活性中也发挥着重要的作用，通过直接接触和大量的炎症细胞因子(IL-15, IL-12, IL-18)促进NK细胞增殖，刺激细胞因子产生和诱导细胞杀伤活性。

肝脏NK细胞，尤其是富含免疫调节剂CD56 bright (CXCR6 CCR5 CD69 )亚群的NK细胞，代表了肝内淋巴细胞中最丰富的群体(高达50%)，而浸润HCC的NK细胞表达记忆样NK细胞标志物，如KLRC1和KLRC2。在人肝癌中，高数量的NK和CD8 T细胞预示着疾病早期阶段较好的预后，并与凋亡肿瘤细胞呈正相关。尽管如此，NK细胞通常会失去抗肿瘤特性。在Ⅲ期HCC患者(n=110)中，外周血和肝脏CD56 dim NK细胞的频率降低，而免疫调节剂NK细胞的频率增加(156)。肿瘤内的CD56 dim NK细胞表达免疫检查点分子PD-1和NKG2A，与不良预后相关(n=207) (图6A)。在体外，阻断IL-10特异性地抑制了NK细胞中NKG2A的表达，表明靶向IL-10可以通过逆转NK细胞耗竭来恢复免疫。此外，MDSCs和肿瘤细胞通过NKp30对NK细胞产生抑制作用。来自HCC组织的单核细胞与循环中的NK细胞一起孵育，导致短暂的活化，然后通过CD48/2B4对话触发与细胞死亡相关的强烈耗竭。最后，索拉非尼在体外和荷瘤小鼠中通过巨噬细胞分泌的细胞因子(IL-12,IL-18, IL-1β)诱导NK细胞活化，提示增强NK功能可能是索拉非尼抗肿瘤作用的机制。总的来说，在肝癌中，NK细胞由于其不同亚群之间的失衡而失去抗肿瘤功能，促使免疫调节亚群劫持免疫监视。这些研究为NK介导的治疗策略开辟了新的途径，包括活化NK细胞的过继转移、给予激活NK细胞功能的分子，以及使用阻断抑制性受体与其配体之间相互作用的抗体。

作为免疫治疗的NK细胞过继转移需要其体外扩增和随后的强体内活性、持久性和细胞毒性。NK细胞可来源于干细胞、健康供者的外周血NK细胞(异基因状态)、患者(自体状态)或NK-92细胞系。有趣的是，注射来自外周血的同种异体NK细胞联合HCC冷冻消融改善了整体免疫功能，降低了AFP的表达，并与较长的无进展生存期相关(n=61)。在两项III期临床试验中，NK细胞因子诱导的杀伤(CIK)疗法耐受性良好，改善了总生存期(n=200;n = 270)。最近，一项I期研究报告了使用同种异体CIK预防肝移植后HCC复发(n=18, NCT01147380)。类似地，人NK-92细胞系表现出高细胞毒活性，并且可以在良好的制造条件下扩增，当注射到患者体内时显示出有希望的抗肿瘤反应。在13例难治性肺癌患者中，两次注射NK-92细胞均足以引发抗肿瘤反应，且未观察到长期副作用，表明它们可作为一种有前景的治疗方法(171例)。此外，经遗传修饰以表达嵌合受体NKG2D-CD3ζ-DAP10(分别包括受体、信号结构域和信号衔接子)的同种异体NK细胞在体外和免疫缺陷荷瘤小鼠中被证明可增强抗HCC细胞毒性。

近年来，嵌合抗原受体CAR-T细胞的出现为癌症治疗带来了革命性的变化。简而言之，CAR是由一种人工修饰的融合蛋白组成，该融合蛋白结合了细胞外抗原识别域、间隔区和跨膜区，并与广泛的细胞内信号域融合。CAR-NK细胞现在被用于提高NK细胞的靶向性和疗效。在肝癌中，使用CAR修饰的NK-92细胞特异性靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (GPC3)阳性肿瘤细胞。最近，NKG2D-CAR-NK细胞能够延缓3例化疗难治性转移性结直肠癌患者的结直肠癌进展，这提示使用CAR-NK细胞治疗患者的可能性 (图6B)。

  NK细胞在HCC中的功能挽救可能代表了新的免疫治疗的另一种策略。HCC患者循环NK细胞的代谢缺陷和功能受损可部分归因于TGF-β信号。用抗TGF-β剂孵育健康供者的NK细胞可部分恢复NK细胞的功能缺陷，表明TGF-β可能是一个合适的免疫治疗靶点。尽管IL-15具有潜在毒性，但由于其在NK细胞增殖、存活和细胞毒性中的作用，也有人提出将其作为癌症治疗的潜在候选药物 (图6B)。另外，在肿瘤发生过程中增强NK细胞介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)可能是一种激活NK细胞并杀伤肿瘤细胞的方法。双特异性杀伤细胞衔接器(bispecific killer cell engagers, BiKEs)目前有很大的期望，它由两个抗体片段组成，一个识别肿瘤抗原，另一个识别NK细胞上的CD16a，使它们更接近并形成免疫突触，从而诱导NK细胞的杀伤功能。

新NK细胞群的发现使我们能够推测，特异性抑制免疫调节剂NK亚群可能具有治疗潜力。培养的CD96 NK细胞低表达穿孔素和颗粒酶B，并伴有PD-1、NKG2A、IL-10和TGF-β的表达。然而，通过阻断CD96及其配体CD155之间的相互作用，在体外逆转NK细胞的耗竭可以恢复NK细胞的细胞毒性。与其他免疫抑制受体共同靶向CD96可能提供更强大的抗肿瘤免疫应答。最近，人源化抗NKG2A抗体monalizumab通过增强NK细胞和CD8 T细胞促进的肿瘤免疫，在头颈部鳞状细胞癌中显示出良好的疗效。最后，除了其他抗肿瘤作用，瑞戈非尼还抑制了肝癌细胞系中ADAM9和ADAM10的表达，导致膜上MICA NKG2D -配体)的表达升高和MICA分泌水平降低，从而导致更高的细胞毒性NK细胞活性。瑞戈非尼与NK细胞治疗策略的联合应用有可能增强瑞戈非尼的抗肿瘤作用。

 利用NK抗肿瘤活性作为一种新的免疫治疗方法，在实体肿瘤和血液系统恶性肿瘤中显示出有前景的效果。所有这些靶向NK细胞的策略单独使用或与其他治疗方法联合使用，有望增加肿瘤部位NK细胞的数量和活化。

T细胞是抗肿瘤的领头羊

 在肝癌中，CD8 和CD4 T细胞分别在肿瘤内和瘤周区域富集。肿瘤内低水平的Treg和高数量的活化CD8 T细胞与患者的良好预后相关(n=302)。在HCC中，Treg细胞介导T细胞功能障碍，它们在肿瘤内的存在与较差的预后相关。最近，scRNAseq分析了6例HBV treatment-naïve HCC患者(190例)的T细胞多样性。耗竭的CD8 T细胞(PDCD1 CTLA4 )和Tregs (TIGIT CTLA4 )在肿瘤内富集并表达LAYLIN (LAYN)抑制标志物。有趣的是，TCR测序显示，在血液和正常肝组织中，10%的CD8 T细胞携带克隆性TCR，而在肿瘤中达到30%。根据轨迹分析，耗竭的CD4 和CD8 T细胞分别与表达GZMA和GZMK标记的中间群体密切相关，而不是与效应群体密切相关，这表明潜在的治疗策略更倾向于激活而不是耗竭。不同的CD4 T细胞群，包括Th1, Th2, Th17和调节性T细胞，可以被特定的细胞因子和趋化因子的平衡诱导，包括TGF-β和IL-6。

在HCC中，PD-1及其配体PD-L1/2的表达已被深入研究。在生理条件下，它们的表达是一种防御机制，以防止自身反应性T细胞的激活和健康细胞的死亡。对HCC的开拓性研究表明，CD8 T效应细胞上的PD-1表达增加，并且PD-1与表达PD-L1/2的肿瘤相互作用，从而阻断T细胞的信号传导、增殖和细胞因子分泌。在HBV感染患者队列中，随着疾病进展，循环PD-1 CD8 T细胞的频率增加。CD8 T细胞通过IFN γ依赖方式诱导肝癌细胞表达PD-L1，进而促进T细胞凋亡。具有离散的PD1高表达细胞群的HCC更具侵袭性，但预计对抗PD1治疗有应答 (图7A)。2018年，James P. Allison和Tasuku Honjo因发现免疫检查点(即癌症免疫治疗的靶点)而被授予诺贝尔生理学/医学奖。针对免疫检查点(如PD-1和CTLA-4)的抗体可破坏共抑制性T细胞信号传导，从而重新激活针对肿瘤细胞的免疫应答。针对PD-1(纳武利尤单抗和帕博利珠单抗)和PD-L1(阿替利珠单抗、durvalumab和阿维鲁单抗)的ICI已经在包括HCC患者的一系列临床试验中进行了测试。最近一项包含8项试验的荟萃分析显示，与非病毒相关的HCC相比，ICIs在病毒性肝炎患者中更有效，而在接受TKI/抗VEGF治疗的患者中，在病因学方面没有观察到差异。此外，接受抗PD1或抗PDL1治疗的两个NASH驱动的HCC队列显示，与其他病因的患者相比，总生存期缩短，这强化了NASH驱动的HCC似乎对免疫治疗反应较差的假设。鉴于本研究中NAFLD患者数量相对较少(198例)，我们仍需要前瞻性验证来加强这些数据。有趣的是，与这项工作一致，Dudek等发现，在胆碱缺乏的高脂饮食(CD- HFD)小鼠模型和人类NASH组织中，非常规的驻地活化和耗竭的肝脏CXCR6 PD1 CD8 T细胞增加:这些细胞参与组织的自身攻击，并可能通过加强慢性肝损伤促进HCC发展。

大多数肝癌不富集炎症TME反应，因此构成了一大类对ICI可能几乎没有反应的肿瘤。免疫活性肝癌的特征是活跃的辅助性CD4 T细胞和细胞毒性CD8 T细胞浸润，易对ICI产生应答。相反，免疫耗竭的HCC与CD8 T细胞耗竭、Treg细胞增加和NK细胞激活剂下调相关。这一组与增殖祖细胞亚类和CTNNB1突变亚类G5-G6重叠。我们的实验室已经报道，CTNNB1突变的肿瘤通过CCL5细胞因子的减少发生免疫逃逸和对ICI的耐药，这损害了DC募集和导致无效的CD8 T细胞肿瘤清除。最后，放疗增强了肿瘤的免疫原性，其与ICI的联合正在被评估用于HCC (NCT03203304, NCT04611165, NCT03482102)(203)。综上所述，显然只有一部分患者可从免疫治疗中获益，因此需要确定与ICI应答的稳健预测因素相关的疾病进展标志物，以及将耐药肿瘤转化为有应答肿瘤的联合策略。

 针对特异性TAA的CD8 T细胞应答被认为是潜在的免疫抗肿瘤力量，但它们在HCC中没有很好地扩增，提示其诱导效率低和抗原识别受限。事实上，在肝细胞癌患者中，尽管颗粒酶B和效应细胞因子水平低，但TAA特异性CD8 T细胞(PD-1 TIM3 LAG3 )已被描述为活化标志物上调。有趣的是，接受射频消融治疗的患者表现出TAA特异性T细胞反应，与MDSCs减少和HCC复发减少相关。在HCC中，AFP是研究最多的TAA，因为AFP的CTL表位在肿瘤发生的早期阶段被鉴定。在75%的HCC患者(207例)中，AFP被转录激活并高表达，血清AFP水平被用作疾病的生物标志物，因为它与生存期呈负相关(208例)。基于AFP肽的免疫在一个小队列的患者中只显示出适度的临床反应。经HLA-A2/AFP复合物特异性小鼠TCR转导的人T细胞可识别HLA-A2 AFP HepG2细胞，在体外和荷瘤免疫抑制小鼠中导致细胞因子产生和肿瘤死亡。一项正在进行中的1期临床试验(NCT03132792)正在评估过继转移识别HLA-A*02限制性AFP158-166肽FMNKFIYEI的工程T细胞的安全性。虽然在欧洲和北美，HLA-A2是最常见的HLA-A等位基因，但在亚洲并不常见。因此，我们设计了针对AFP2-11 -HLA-A*24:02限制性肽段KWVESIFLIF (AFP2-11)的特异性KWV3.1-TCR，该肽段能够杀伤AFP HLA-A*24:02 肿瘤细胞株。最近，微波消融治疗HCC患者(n=23)发现30%的患者通过增强TAA产生新的或增强的肿瘤特异性免疫反应。这一缓解与长期生存相关，因此支持局部消融联合免疫治疗。此外，HCC-TAAs如GPC3和AFP也正在测试作为CAR-T的靶点。在终末期HCC患者中，输注自体HBV特异性CAR-T细胞能够靶向表达HBsAg的HCC细胞，而不会加重肝脏炎症或毒性。GPC3- CAR - T细胞能够在患者来源的异种移植中清除GPC3 HCC细胞和肿瘤，最近已在Ⅰ期临床试验中验证了其在晚期GPC3 HCC患者中的安全性和潜在疗效(NCT02395250和NCT03146234, n=13)。通过CRISPR/Cas9干扰PD-1或共表达共刺激分子ICOSL-41BB的方式制备了第二代和第三代CAR-T细胞(图7B)。两者都提高了CAR-T细胞在荷瘤小鼠体内的持久性和浸润性。此外，在两个GPC3 ASGR1 HCC异种移植模型中，针对GPC3和去乙酰化糖蛋白受体(ASRG1)的双靶向CAR-T细胞发挥了优于单独GPC3-CAR-T细胞的抗癌活性和持久性。基于NKG2D的CAR-T细胞在体外和NKG2DL 肝癌异种移植中显示出对NKG2DL 肝癌细胞的有效破坏。一项II期临床试验(NCT02541370)最近报道，靶向肿瘤干细胞标志物CD133的CAR-T-133细胞在晚期HCC患者中表现出抗肿瘤活性和可控的安全性(n=21)。最后，两种CD19-CAR-T疗法被FDA批准用于治疗复发性和难治性前b细胞急性淋巴细胞白血病和弥漫性大b细胞淋巴瘤，作为首批基因疗法的例子。

B细胞联合起来抑制或促进癌症

 B淋巴细胞在ADCC和抗原呈递中具有不同的功能，越来越多的证据表明，通过产生细胞因子，B淋巴细胞在调节固有和适应性免疫中发挥另外的作用。虽然B细胞曾被认为是HCC的被动参与者，但肿瘤浸润B细胞(tumor-infiltrating B cells, TIBs)的作用仍存在争议。

 肿瘤边缘区域CD20 B细胞的增加与良好的预后相关，与较小的肿瘤大小、无血管侵犯和CD8 T淋巴细胞密度增加相关，尤其是在HBV相关的HCC (n=120)。同样，在两个独立的HCC队列(n = 619)中，高密度B细胞亚群延长了生存期。浆细胞是最丰富的群体，提示B细胞反应发生在TME中。此外，定义为CD20 - CD79α 细胞的浆细胞与较好的预后显著相关。此外，TIBs的密度与T细胞和NK细胞的数量和活化状态呈正相关，并与肿瘤细胞活力的降低相吻合(n=112)。TIBs密度与肿瘤细胞凋亡密度呈正相关，与肿瘤细胞增殖呈负相关。此外，对全癌症转录组(n=2,158例患者)进行的无监督基因表达分析显示，CD20细胞和CD79a细胞的浸润与患者生存期延长和免疫球蛋白分泌相关。基于免疫组织化学的深入研究表明，非典型CD20 记忆性B细胞(IgD - IgG CD27 - CD38 -)具有肿瘤杀伤潜能，并与CD8 T细胞合作，与良好的预后相关。这些结果提示B细胞亚群可能增强肝癌的抗肿瘤作用。使用二乙基亚硝胺(DEN)诱导的肝癌小鼠模型表明，T细胞阻止初始肿瘤形成，而B细胞限制生长。缺乏B细胞的Igh6 -/-小鼠比WT小鼠发生更多更大的肿瘤。用CD20抗体去除B细胞导致移植的肝癌细胞(Hepa1-6)在小鼠体内的肿瘤生长增强，主要是由于CD4 T细胞活化减少。此外，CD20清除还与CD8 T细胞上PD-1表达增强相关，表明CD8 T细胞活化可受到CD20 B细胞的影响 (图8A)。

B细胞也可能发挥促肿瘤作用。最近的一项研究报道，在HCV诱导的HCC患者中，肿瘤内CD20 B细胞的高浸润与低分化和低无病生存率相关。在肝癌小鼠模型(Mdr2 - / -小鼠)的肝脏中，B细胞分泌促炎细胞因子如TNF-α。因此，在慢性炎症驱动的HCC小鼠模型中，IgA B淋巴细胞通过积极对抗CD8 (PD-1 Tim3 ) T细胞功能来支持肿瘤生长。PD-L1阻断足以降低肝脏IgA IL-10 细胞丰度和增加CD8 T细胞。其他B淋巴细胞也参与了HCC的进展，包括B调节性细胞(Bregs)， Bregs通过产生IL-10发挥强大的免疫抑制功能，其作用正在被深入研究。在HBV相关的HCC患者(n=28)中，CD4 T细胞介导的细胞毒性被Tim-1 IL -10表达的B细胞负性控制。Breg群体在人类中的特征为CD19 CD24 hi CD38 hi，在小鼠中的特征为CD19 CD21 hi CD23 hi IgM hi CD24 hi。总之，Bregs在HCC TME中富集，并与肿瘤进展相关。与健康人相比，HCC患者(n= 80)循环中Bregs聚集，而B记忆细胞(CD24 CD38 - /CD19 )减少。在严重的联合免疫缺陷(SCID)异种移植小鼠中，B细胞和T细胞缺乏，注射Bregs通过迁移到肿瘤和产生IL-10影响HCC肿瘤的生长。给予抗CD154 (CD40L)抗体可抑制肿瘤生长。在Bregs和HCC细胞共培养中，抑制CD40/CD40L轴导致TGF-β1和IL-10的分泌减少，而TNF-α的分泌增加，表明Bregs促进了一个强大的抗炎环境。另一个Breg亚群在人肝癌中的特征是高水平的PD-1和IL-10的表达(CD5 hi CD24−/ CD27 hi/ CD38 dim)。PD-1高表达B细胞比例较高的患者在12个月后出现早期复发。本研究提示PD-1高表达的B细胞可能被PD-L1 单核/巨噬细胞激活，从而产生IL-10，随后CD8 T细胞失活。在另一个人肝癌队列(n=35)中，50%的B细胞表现出CD20 FcγRII(CD32)低/−活化表型，并且它们在肿瘤中的聚集与患者的肿瘤-淋巴结-转移分期呈正相关。有趣的是，这一特殊的B细胞亚群的激活是由半成熟的树突状细胞协调的CD95L依赖方式触发的。然而，CD20 FcγRII高亚群是小鼠产生IL-10的主要来源。事实上，靶向CD95轴可以抑制Breg的活化和IL-10的产生。一项基于索拉非尼治疗晚期HCC的临床试验(n=62)表明，外周血Breg比例降低的患者预后较好。这些数据提示，外周血中的breg比例可能预示索拉非尼的疗效(图8B)。

B细胞亚群具有高度异质性，部分B细胞亚群在肿瘤微环境中共存。未来需要对B细胞谱进行进一步研究，以确定潜在的靶向亚群和分子，并在未来的临床试验中探索治疗方法。

总结

HCC肿瘤呈现出肿瘤细胞与其他细胞群相互作用的复杂环境。TME由一系列免疫细胞、癌症相关成纤维细胞和内皮细胞组成，它们通过生长因子促进癌细胞生长，并促进增殖、免疫逃逸和血管生成。单细胞RNA测序研究最近强调，与HCC肿瘤细胞相比，肝脏TME在患者之间表现出更一致的模式，这提示治疗TME可能是比单独治疗肿瘤细胞更好的策略，以绕过肿瘤的变异性和多样性。这一观点进一步得到以下事实的支持:HCC中主要的突变驱动基因仍然无法被药物治疗。理解TME的作用越来越受到关注，因为它在临床结局和治疗反应中发挥着重要作用。新型免疫疗法的出现已经开始改变肝癌治疗的格局。去年，阿替利珠单抗(抗PD- L1)和贝伐珠单抗(抗VEGF)联合治疗被美国FDA批准作为晚期HCC的一线治疗，代表着HCC治疗的新时代。然而，只有免疫活性的HCC亚型被认为对治疗有反应，并且没有特异性的血液标志物可以轻易识别有反应的患者。在这种情况下，了解致癌通路和免疫反应之间的相互作用对于提高当前和未来治疗的疗效至关重要。此外，了解不同免疫细胞之间以及免疫细胞与基质细胞(如HSC或CAFs)之间的相互作用，对于开发肿瘤微环境的治疗至关重要。例如，根据不同的环境，衰老的HSC可以通过与免疫系统的环境依赖性相互作用来限制或促进肿瘤的发生。在未来，精准医学将彻底改变HCC的治疗，越来越多的证据表明，接受个性化治疗的患者将获得更好的临床结局。

文献来源：Donne R, Lujambio A. The Liver Cancer Immune Microenvironment: Therapeutic Implications for Hepatocellular Carcinoma. Hepatology. 2022 Aug 21.