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寡糖基转移酶（OST）存在于内质网（ER）腔内，能够使天冬酰胺（N）位点发生N-糖基化。人体细胞表达两种具有部分重叠功能的 OST 复合物（STT3A 和STT3B），STT3A 可调节翻译过程中的糖基化，而 STT3B 可催化翻译后的糖基化。OST 复合物对人的健康和发育也具有重要作用，STT3A 或STT3B 的表达降低可引起人的先天性糖基化障碍。目前对 STT3A 和 STT3B 在 N-糖基化中作用的研究，主要基于 siRNA 处理的 HeLa 细胞中糖蛋白的脉冲追踪标记实验，但这种方法受限于糖蛋白的尺寸（<80 kD），单次实验中检测的蛋白数量也有限。 7月11日，Journal of Cell Biology在线发表了一篇题为“Quantitative glycoproteomics reveals new classes of STT3A- and STT3B-dependent N-glycosylation sites”的文章。使用N-糖基化蛋白质组学技术，弥补了脉冲标记实验的缺陷，研究了 OST 复合物的作用位点。该文章检测了野生型和突变型人体细胞中大约1,000个糖基化位点。通过比较突变型和野生型中糖基化位点的占比差异，揭示了几种新的 STT3A 的糖基化作用位点，包括具有次优侧链序列和富含半胱氨酸蛋白的位点；发现了位于多跨膜 loop 中 STT3B 的糖基化作用位点。进一步通过脉冲标记实验对上述特征蛋白进行了验证。
1.相对于 STT3B，STT3A 能够影响更多的糖基化位点
STT3A-/-和 STT3B-/-（基因缺失突变型）中分别鉴定到1070和907个糖基化位点。分别比较 STT3A-/-和 STT3B-/-与 WT（野生型）中糖基化位点占有率。Δlog2值，负值表示突变型中糖基化位点表达量减少。STT3A 缺失细胞中大约70％的糖基化位点表达量减少（Δlog2<0）（图1A），19%超过两倍降低；而 STT3B 缺失细胞中大约50％的糖基化位点减少（Δlog2<0）（图1B），不到10％的位点两倍以上减少。说明 STT3A 可以影响更多糖基化位点。
图1 不同细胞系中糖基化位点的定量情况 2. 多跨膜蛋白的 N-糖基化位点分布情况 对于 STT3A-/-和 STT3B-/-多 跨膜蛋白中糖基化位点的分布情况进行统计，发现受 STT3A 强烈影响（Δlog2<-1）的糖基化位点大部分位于 N 末端（图2A，插图），而受 STT3B 强烈影响（Δlog2<-1）的糖基化位点大部分位于 loop 中（图2C）。总的来说，肽段序列 NXS/C 对 OST 复合物的敏感度比肽段序列 NXT 更高（图2B 和图2D）。（N为天冬酰胺，T 为苏氨酸，S 为丝氨酸，C 为半胱氨酸，NXT/S/C中X≠P） 
图2 多TM蛋白中糖基化位点的定量情况 由于 NXT/S/C 位点的X残基侧链会影响糖基化的效率，统计X位置的氨基酸概率（图3B）和对侧链序列进行评分（图3C和图3D），发现半胱氨酸（C），甘氨酸（G），缬氨酸（V），异亮氨酸（I）和酪氨酸（Y）在NXT和NXS/C的X位点均呈阳性（观察/预期值大于1），说明X位置的氨基酸残基不是随机的；发现序列 NXS/C 是去糖基化的次优序列（评分为负的很可能是去糖基化的次优序列），且 STT3A-/-中次优化序列得到明显富集，说明 STT3A 对于翻译过程中糖基化的作用增强了次优序列的糖基化。
图3 次优化位点的N-糖基化 由于 STT3A 的底物激活蛋白原和颗粒蛋白是富含半胱氨酸的糖蛋白，以4%为阈值，得到本次结果中192个（17%）的糖蛋白是富含半胱氨酸的。在STT3A/wild type 组中，大部分（184个中的131个）富含半胱氨酸的糖基化位点Δlog2<0（图4A），表明 STT3A 的底物蛋白中很多都是富含半胱氨酸。LRP1 和 MPRI 是两个富含半胱氨酸的糖蛋白，且有多个 OST 的受体位点（图4C）。对于 LRP1，位于富含半胱氨酸的结构域（LDLRA）或结构域边界的糖蛋白位点是受 STT3A 影响的（图4D，红色圆圈），而几乎没有受STT3B 影响的（图4D，只有一个红色圆圈）。对于 MPRI，几乎所有糖蛋白位点都受 STT3A 影响（图4E）。
图4 富含半胱氨酸的蛋白的N-糖基化
选择几种具有上述特征的糖蛋白用[35S]甲硫氨酸和半胱氨酸进行脉冲标记以验证 N-糖基化蛋白质组学的结果。发现半乳糖凝集素蛋白 LG3BP，主要受STT3B 的影响（图5A）；多跨膜蛋白 GLUT1，主要受 STT3B 影响（图5B）；Clusterin（丛生蛋白）主要受 STT3A 影响（图5C）；富含半胱氨酸的糖蛋白 MEGF9，主要受 STT3A 影响（图5D，左侧）；具有次优侧链的蛋白 KDEL2，主要受 STT3A 影响（图5E）。综上，这些典型糖蛋白的脉冲标记实验结果与前期的组学结果基本是一致的，进一步验证了组学的分析结果。
图5 所选糖蛋白的脉冲标记结果 该文章采用N-糖基化蛋白质组学技术，极大的增加了传统脉冲标记技术所检测的N-糖基化位点数量，通过位点分析和脉冲实验验证，充分说明了 OST 复合物（STT3A 和STT3B）对于不同蛋白序列的影响，揭示了两种 OST 复合物的不同作用方式。本文可以说是组学技术和传统技术结合的启发性研究，通过组学方法研究了 OST 复合物作用的糖蛋白位点，结合传统脉冲标记技术证实了组学的分析结果，体现了组学技术在修饰蛋白质机理研究方面的价值。 参考文献： Natalia A.C, Sergey V.V, John D.L, et al. Quantitative glycoproteomics reveals new classes of STT3A-and STT3B-dependent N-glycosylation sites[J]. Journal of Cell Biology, 2019, 218(8): 2782-2796.
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