 摘要 神经元发育是一个有利于生存的过程，涉及到神经突起的生长，突触的发生，突触和神经元的修剪。在发育过程中，这些过程可以通过由长的非编码RNA和微RNA编排的时间基因表达来控制。为了研究转录组的这些不同成分在神经元分化过程中的相互作用，我们对成熟的原代神经元进行了mRNA、长非编码RNA和microRNA表达谱分析。随后的基因本体分析揭示了这些差异表达的mRNAs和非编码RNAs对轴突发生和树突发生过程的调控。时间调控的mRNAs及其相关的长非编码RNA在增殖和分化相关的信号通路、细胞粘附和神经营养因子信号通路中明显过表达。 研究结果  图1 图1：E15衍生的小鼠原代皮质神经元培养的成熟.。对培养的神经元标记物(map2和Neun)、神经前体标记物(Sox2)、小胶质细胞标记物(CD11b)、少突胶质细胞标记物(O4)和星形胶质细胞标记物(GFAP)进行免疫染色。E15培养物中无神经元前体细胞和胶质细胞，含.99%的神经元细胞。发育早期(第2天)的短轴突起在第8天形成广泛的轴突网络。以E18星形胶质细胞富集培养作为CD11b，O4和GFAP染色的阳性对照。比例尺代表50 mm。  图2 图2：成熟神经元的转录组。 (A)成熟皮层神经元中mRNAs的层次聚类分析。鉴定了高度下调和上调的mRNA簇。 Bi)成熟神经元中的lncRNA。鉴定了高度下调和上调的lncRNA簇，这些lncRNA的方向是基因组或近端基因位点。(Bii)改变的lncRNAs与其附近的编码基因相关的亚组分析。 (C)成熟皮层神经元中的miRNAs。鉴定了高度下调和上调的miRNAs簇。来自4个单独实验(n=4)的总RNA以三份进行，每个时间点汇集在一起。对汇集的RNA上的每个时间点进行微阵列分析。在第2天、第4天、第6天和第8天，lncRNA和mRNA微阵列的平均信号强度分别为369.03，501.12，429.58和455.03。对于miRNA微阵列，第2天、第4天、第6天和第8天的平均信号强度分别为1673.43、1783.01、1385.10和1698.38。以平均连锁度和欧氏距离作为相似性度量，构建了层次聚类。绿色矩形表示下调，红色表示上调。  图3 图3：差异表达RNA转录组与(A)细胞粘附分子调节，(B)增殖和分化途径，(C)神经营养素信号途径，(D)差异表达Ikbkb及其相关的ncRNAs，由微阵列确定(每个时间点4个单独实验的混合RNA)。 该基因的mRNA表达随后是相关的lncRNA的表达(S：正义重叠；AS：反义重叠；B：双向)。差异表达的miRNAs被预测为靶向基因(TargetScan和microRNA.org)。验证的miRNAs下划线。表达在SLR中表示相对于第2天。红色表示上调，绿色表示下调。  图4 图4：原代神经元缺氧缺糖(OGD)。 (A)亮场免疫染色图像，显示受OGD影响的健康神经元培养中的细胞死亡。受到越来越多缺血损伤的细胞显示变性的轴突。BF-Bright-field；Green-Map2；Blue-Hoechst 33342。比例尺代表50 mm。 (Bi)原代培养的神经元进行氧化脱氧处理，用核染色法Hoechst 33342(蓝色)和坏死细胞标记物乙锭同源二聚体III(红色)染色。暴露于OGD显示凋亡细胞增加，表现为浓缩的细胞核(绿色箭头)和坏死细胞(红色开放箭头)。(Bii)健康细胞以占细胞总数的百分比(平均6SD)表示。所有实验均为n=4，一式三份。使用学生t检验统计学显著性差异(*p，0.05，*p，0.01)。  图5 图5：由lncRNAs和miRNAs调控的基因整合网络概述，这些基因对神经元的精确发育至关重要。上调的mRNAs/lncRNAs/miRNAs以红色字体显示。绿色字体表示下调的mRNAs/lncRNAs/miRNAs。 与该基因相关的lncRNA下划线。基因上的黑色固体反馈箭头(R)表示与具有协同表达的基因相关的lncRNA。黑色抑制箭头(H)表示与具有相互表达的基因相关的lncRNA。指出了针对各自基因的10个差异表达的miRNAs。从miRNAs中出现的实线(-)表示已验证的目标。虚线(-)表示由TargetScan和microRNA.org确定的预测目标。灰色阴影的miRNAs(miR-329，-377，-495)属于miR-379-410簇。   图6 图6：通过qPCR验证和定量mRNA，lncRNA和miRNA的表达。 (A)Ncam1mRNA(NM_010875)和lncRNA(AK156022) (B)Negr1mRNA(NM_001039094)和lncRNA(uc008rva.1) (C)Ncam1和Negr1mRNA-lncRNA对。 (D)成熟神经元中miR-377的茎环PCR定量。GAPDH的表达作为控制/管家基因，使mRNA、lncRNA和miRNA表达正常化。使用学生t检验统计学显著性差异(*p，0.05，*p，0.01)。 总结 在体外缺血再灌注损伤模型中验证Axin2，Prkcb，Cntn1，Ncam1，Negr1，NRXN1和Sh2b3 mRNAs及其相应的长非编码RNA的表达显示出与成熟过程相反的表达谱，从而表明它们在维持神经元结构和功能中的作用。此外，我们提出细胞粘附分子Ncam1和Negr1的表达可能受到长非编码RNA和microRNAs的紧密调控。 DOI：10.1371/journal.pone.0103525.g006 参考文献 [1].Petanjek Z, Judas M, Simic G, Rasin MR, Uylings HB, et al. (2011) Extraordinary neoteny of synaptic spines in the human prefrontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A 108: 13281–13286. [2].Goyal MS, Raichle ME (2013) Gene expression-based modeling of human cortical synaptic density. Proc Natl Acad Sci U S A 110: 6571–6576. [3].Webb SJ, Monk CS, Nelson CA (2001) Mechanisms of postnatal neurobiological development: implications for human development. Dev Neuropsychol 19: 147– 171. [4].Waites CL, Craig AM, Garner CC (2005) Mechanisms of vertebrate synaptogenesis. Annu Rev Neurosci 28: 251–274. END 为帮助科研人员快速找到所需文献，节省科研时间，提高科研效率，我们上线了医学小助手,扫描二维码添加即可一对一解答问题,全部免费哦！ |
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