|
染色体重排是形成融合基因最常见的机制，包括缺失、易位、倒位和串联重复。目前大量研究显示融合基因的存在与肿瘤发生存在因果关系，约占肿瘤发生原因的20%[1]。通过对融合基因的精确检出，能为患者的后续治疗提供更多的帮助，例如ALK抑制剂克挫替尼（crizotinib）可抑制非小细胞肺癌进展，ABL激酶抑制剂伊马替尼（imatinib）可达到治疗和缓解白血病的效果；除此之外，融合基因还可作为预后判断的分子标志物，比如BCR-ABL1融合转录本的表达量可以作为化疗预后评估的标志物[2]。 临床上，融合基因检测技术方法比较常用的方法是FISH或者RT-PCR，但是融合基因的类型很多，而这两种技术只能坚持单基因融合且操作复杂，性价比低，只能检测已知的融合类型且基本上检测单基因融合，操作复杂且性价比低。而基于DNA的靶向二代测序可一次性高通量的检测多种基因的融合，但是融合基因的断点位置常常位于内含子区域，由于内含子部分序列的复杂性、探针覆盖度问题、生信分析流程等问题，会造成融合检测准确度存在问题。而靶向RNA测序的方法[3]结合靶向DNA捕获有望解决以上问题，使用RNA进行融合检测，再加以生信流程去找到异常的外显子拼接，能实现融合基因检测的高准确度。 图1：靶向RNA测序流程说明  元码基因从去年开始就着手于使用靶向RNA测序进行融合检测、组织溯源及分子分型检测。在融合检测方面，为了统一检测流程并且提高检测结果的准确性，发明了一种DNA RNA共同进行肿瘤基因突变检测的高通量测序方法。
图2：DNA+ RNA共捕获流程示意图 首先从探针设计入手，除了常规转录本的平铺设计外，查阅已有文献及数据库，统计已有融合基因的junction reads，针对“突变型”融合reads进行探针设计。融合部分RNA探针设计上具有更好的覆盖度，对于提高检出率和捕获效率更有优势以ROS1基因为例，常发生融合区域为chr6：117641031-117658503，区域大小17472个碱基，若基于DNA设计探针，其中8375个碱基区域不适合设计探针，因为处于高度同源或高度重复的内含子区域，强行设计探针会影响整体的捕获效率，故覆盖度为约为52%。而基于mRNA设计则没有覆盖不全的问题，覆盖度100%。部分DNA水平融合基因检测区域存在重复序列，也直接影响到NGS测序生信分析和准确定位，这些问题都可以通过RNA水平的融合断点检出而得到更好的解决方案。更好的覆盖度带来更好的融合检出，同时由于发生融合后基因会出现高表达，在mRNA层面上更易被检出。在DNA样品检出率偏低的情况下，基于RNA水平的融合检出成为有效补充，除此之外，在常规转录本的平铺探针设计的基础上增加junction probe大大增加了融合检测的灵敏度。 图3：RNA融合探针优化设计 其次针对病理切片或新鲜组织进行DNA、RNA的共提取，并测定DNA、RNA的含量和比例，共同建库，针对靶基因进行探针设计，并进行共同捕获后上机测序。该实验方案对现有流程进行了整合，更经济便捷，无需再通过Target DNA-Seq+Target RNA-Seq两套NGS流程，或者Target DNA-Seq+qPCR/FISH两个平台的流程进行基因突变检测。（该内容已申请专利，目前专利已是公开阶段）在同一次杂交反应中可以同时得到DNA部分的点突变、CNV、融合、MSI等信息、以及RNA部分的融合基因检出信息，这样不仅可以在提高融合检测准确性的同时依然拥有常规靶向检测的信息，而且DNA部分的结果和RNA部分的结果可以相互校准，同时也不会有太多成本的增加；除此之外，我们在生信分析流程上使用自主开发的目标基因结构变异的方法，在检出结果上也有了更高的灵敏度和特异性。以上成果已申请相关专利。 因为RNA靶向测序这种高通量、高准确性的优点以及广泛的应用场景，作为DNA结果的补充和升级，配合不断优化的实验和生信方案，同时结合二代、三代的测序平台，相信会在临床有越来越广泛的应用。 参考文献 1、Mitelman F, Johansson B, Mertens F. The impact of translocations and gene fusions on cancer causation[J]. Nature Reviews Cancer, 2007, 7(4): 233. 2、Hughes T, Deininger M, Hochhaus A, et al. Monitoring CML patients responding to treatment with tyrosine kinase inhibitors: review and recommendations for harmonizing current methodology for detecting BCR-ABL transcripts and kinase domain mutations and for expressing results[J]. Blood, 2006, 108(1): 28-37. 3、Heyer E E, Deveson I W, Wooi D, et al. Diagnosis of fusion genes using targeted RNA sequencing[J]. Nature communications, 2019, 10(1): 1388.
|
|
|
