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二代测序近年来飞速发展，做过文库构建的小主们，是不是曾经深受文库产量低、质量差、测序数据不好这些问题的困扰？如何一步步排查问题，找到症结并优化呢？ 别着急，小翊在这里为大家整理了NGS文库构建中的连接模块正确测评方法及连接效率的影响因素，看完以后大家就对接头连接有全局的把握，排除连接模块对文库的影响更是不在话下！ 说到接头连接，就得从文库制备的概念说起了…… 文库制备（Library Preparation）就是在DNA片段两端连上特定序列的接头（两侧的序列不同）的过程，（见图1）。 图1 Illumina平台文库制备流程 在连接接头过程中，不是所有的DNA片段都能两端接上接头，接头连接效率的概念在这里就要引入了。接头连接效率是指在DNA片段两端均加上测序接头的DNA量占起始总DNA量的比值。它是影响文库产量的重要指标之一，对文库的质量和产量具有重要的影响。若连接效率低，那么未连上接头的DNA片段无法得到PCR扩增；连接效率越高，代表文库转化率越高，可以说，接头连接效率直接影响最终的文库复杂度和有效测序数据。 接头连接效率这么重要，要如何对连接效率进行正确的测评呢？ 方法一：对比连接前后文库的量。 指的是测定接头连接前的文库量，然后进行接头连接，纯化后测定剩余的文库量。这类方法被很多人使用，实际上却存在很大的问题。通常连接后文库中，会存在接头、未连接接头片段或者单端连接接头的文库，通过Qubit荧光定量，只能确定总的双链DNA量，无法确定有效的双端连接接头文库的量。因此此方法会与实际结果存在巨大误差。并且磁珠的纯化也有一定的文库损失，具体效率无法准确把控。 方法二：更换连接模块做平行测试。 指的是通过更换不同的连接模块，对比最终文库产量，来评测不同连接模块的连接效率高低。同样，这类方法也存在一些弊端，首先这种方法无法排除不同连接模块与原体系的兼容性对产量的影响，其次这种方法只能间接的反映哪种连接模块更有优势，无法评测具体连接模块的连接效率。 总结： 以上两种接头连接的测评方法其实都犯了一类错误：将关注点放在文库的产量上面而不是具体连接上接头片段的比例。这是因为接头的连接不仅要看接头连接的文库的产量，更要看连接文库的效果，而后者才是评估连接效率的关键因素。 方法一：Agilent 2100检测连接峰图法 小翊对此做了测试，对已知片段大小的DNA片段（350bp）进行接头连接，文库在连接接头后进行Agilent 2100检测，发现会存在5种大小的峰（如图2）：A/347bp、B/396 bp、C/462bp、D/536bp、E/617bp。根据结果我们可以推测这5种峰代表的文库接头连接情况（如图3）。 小翊对上述推测做了验证，将连接后产物进行凝胶电泳，会发现4个条带A、C、D、E，然后将C、D、E切胶回收，并进行PCR扩增，结果显示条带大小一致，（如图4）因此可以证明了我们的推测。（注：因为“Y”型接头在凝胶检测中会出现偏移，所以大小会与实际有些差异。） 结果表明，虽然文库连接上了接头，但是只有两端均连接上了接头的文库才能被扩增和测序。当未连接或单端连接接头的含量很少时，或者双端连接接头的文库含量高时，代表接头连接的效率越高。 图4 接头连接推测验证胶图 方法二：qPCR定量法 qPCR法定量文库的方法是以qPCR为基础，通过标准曲线的校准，精确定量文库中用于双端完整接头的文库数量。因为此方法使用的引物为通用序列，若只有一端连接接头或未连接接头的文库是无法得到扩增，也就是无法检测到荧光值，最终浓度是将这部分文库排除。此方法可以精准的测定文库中成功连接接头的文库数量，以此可以精准的评测连接的效率情况。此方法对操作要求高，耗时长（3-4h），而且需要有文库标准品，成本比较高，所以不推荐大家使用。 看似简单的连接过程，其效率实际受到多种因素的影响，在这里，小翊细心为大家罗列了各类影响因素，供各位小主参考： 1）连接酶 种类：为了提高连接酶的稳定性和酶活性，通过对酶分子进行改造修饰，以便创造出天然酶所不具备的某些优良特性(如较高的稳定性、活性、抗蛋白酶水解等)，甚至于创造出新的酶活性，从而提高酶性能和价值。 活性：温度、pH和酶的抑制剂等条件都会影响酶的活性。 纯度：酶的分离提纯技术是当前生物技术“后处理工艺”的核心。采用各种分离提纯技术，从不同发酵底物中分离提纯目标酶，制成纯度较高的酶制剂，保证酶制剂的活性、纯度和收率的正常发挥。 2）Buffer 种类：连接酶Buffer中通常含有金属离子、盐离子、大分子拥挤剂PEG、小分子物质甘油等，不同的成份组合对连接效率也有重要影响。 浓度：不同Buffer组分的含量通过优化配比，才能很好的发挥出连接酶最大的作用。当然了，这也是不同公司的机密，不作详述。 3）接头 种类：短接头通常30bp左右，无index序列以及P5/P7序列，连接效率可达70%左右；长接头通常60bp左右，包括index序列以及P5/P7端序列，连接效率高达60%。 质量：通常接头为“Y”型接头，末端为不互补的游离状态，相对于双链DNA的稳定性更低。若接头存在降解，则不完整的接头结构肯定会使接头的连接效率下降。 添加量：接头添加量对连接效率也具有重要影响，接头量过少，不用说，肯定连接效率低。接头多的话，易形成二聚体，这就间接的降低了文库的产量。 4）样本长度 样本越长连接的难度将会增加，所以短片段连接要更优于长片段连接。 好啦，以上就是小翊给大家分享的内容，现在大家知道如何评测连和优化连接效率了吧？  最后小翊要给大家良心推荐一款超好用的连接酶，翊圣T4 DNA ligase。T4 DNA Ligase在辅酶因子ATP的作用下，可催化dsDNA或dsRNA上相邻的5´-磷酸末端和3´-羟基末端之间形成磷酸二酯键。翊圣生物不仅生产高质量的普通T4 DNA ligase，同时利用定向改造技术，得到一种连接活性更强的突变型Fast T4 DNA ligase，其具有高效的连接能力，非常适合复杂结构核酸片段的连接，如进行FFPE和cfDNA文库的构建、华大测序平台接头的连接等。 产品优势： 高效连接：连接华大测序平台接头的效率是N** T4 DNA ligase的2倍。 灵活选择：提供普通和高效的T4 DNA ligase，以满足不同实验的不同需求。 严格质控：翊圣T4 DNA连接酶经过严格的质控检测，确保该产品品质。
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