二代测序(NGS)是基于PCR和基因芯片技术,由一代测序发展而来的,可以平行测序的技术,具有通量高,速度更快的优点。在进行NGS实验时,需要把样本DNA提取之后,在进行建库,然后上机测试,最后获得数据后,进行生信分析。在测序整个流程中,对于样本质量的要求非常高。低质量的DNA以及建库产物,会影响到文库转化率,测序的深度,复杂性和均一性等指标。所以测序做的好不好,质控很重要。 图 1 NGS建库和质控流程示例 安捷伦质控仪器,例如2100生物分析仪,Tapestation系统和片段化分析仪等,均可以对NGS全流程进行质控。今天鲁大师就带着大家看看NGS质控要点。 测序样本质控 图 2 使用安捷伦gDNA ScreenTape assay 分析gDNA,DIN值越大,gDNA质量越好 · RNA 图 3 使用片段化分析仪进行RNA 完整性分析. RQN为该仪器数字化评判RNA完整性的指标, RQN值越大,完整性越好。 RNA-seq cDNA合成
片段质量评估 图 5 PCR扩增子片段到350~500bp大小,以获得合适的测序样本。使用安捷伦片段分析仪系统来评估碎片化的程度。(A)非片段PCR扩增子在964bp。(B)超声打断 C和D重复超声打断技术,显示出广泛的片段模式,峰值约为390bp,是下游测序的理想选择 接头连接 图 6 使用安捷伦Tapestation系统的进行接头连接的QC。(A)input DNA(红色)和接头(蓝色)示意图 (B)接头在75bp处有一个峰值 (C)input DNA在165bp (D)以B和C为参考,四个峰值:接头,input DNA,单端接头,双端接头 (E)加号接头的文库最终产物和(F)pcr后带有双端接头DNA插入片段示意图 文库最终产物质控 两大影响因素: 图 7 使用安捷伦生物分析仪进行NGS文库QC。(A)高质量文库 (B)接头二聚体约150bp的例子。 |
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