【新知解读】“酶影迷踪”--NGS建库核心酶知多少？

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图片来自必应图库

随着基因检测技术的普及，NGS在肿瘤精准医疗领域发挥愈发关键的作用。对于这样一个常学常新的技术，热爱探索的你想必有许多疑问，是否经常有小伙伴儿问起：NGS检测背后到底有多少双“看不见的手”在推动反应的进行？

今天，小石头就带领大家从NGS建库核心工作酶视角来领略这一神奇的微观领域。

一、NGS检测流程

酶是一类极为重要的生物催化剂（biocatalyst），具有催化高效性和反应特异性。绝大多数生化反应均需要酶的参与，NGS检测也不例外。

以Illumina测序平台为例，常见的NGS检测流程包括文库构建、簇生成、边合成边测序，以及数据分析四部分（图1）。除数据分析外，其余反应均有酶参与，其中尤以文库构建阶段工作酶种类繁多，让人直呼眼花缭乱。为了帮助大家快速抓到重点，我们就以肿瘤伴随诊断中最常用的建库样本：DNA文库制备为例，给大家拆解下NGS建库核心工作酶吧。

图1.Illumina测序流程

二、DNA文库制备流程

NGS建库方法可以按照接头（Adapter）加入目的片段方式的不同分为：TA克隆连接接头建库、Swift法建库、转座酶法建库、PCR扩增子建库、平末端连接接头建库5种。其中，由于适用样本范围广的优势，TA克隆连接接头建库技术是目前商业化建库方式的主流。具体步骤依次为DNA打断、末端修复及3’端加A、接头连接、文库扩增（图2）。

图2.文库构建流程

文库构建目的是为了得到具备通用接头的、满足测序浓度需求的目的片段。高质量的文库需要包含插入目的片段、测序引物识别序列、Index标签、P5/P7固定接头，缺一不可。我们知道，高通量测序由于读长限制，对插入DNA片段长度一般要求在200bp左右；而组织样本DNA片段通常长度较大，因此需要对其进行打断处理。

目前通常选用声波破碎法，随机的声波打断会造成粘性末端的出现。由于粘性末端碱基序列未知，直接进行接头添加效率极低；而TA克隆技术则能极大提高DNA片段连接效率，为了实现这一目的，且保证文库制备效率和质量，反应过程需要五种酶参与，分别是DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激酶、DNA连接酶，以及高保真DNA聚合酶。

三、DNA建库核心酶功能

3.1 DNA聚合酶(DNA Polymerase)

DNA Polymerase具有5'→3'聚合酶活性（图3），它必须以DNA为模板才能催化dNTP加入引物核苷酸链的3'-OH末端；其具有5'→3'外切酶活性，能切除引物及突变的DNA片段；同时具备3'→5'外切酶活性，能辨认错配碱基，并将其水解。正是这些神奇的特性，使打断后参差不齐的DNA片段摇身一变成平末端。

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图3.聚合酶工作示意图

3.2 Taq DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)

为了保证DNA片段与接头连接高效完成，由于平末端的存在，直接使用DNA连接酶显然行不通。这就需要用到TA克隆技术（Original TA Cloning Kit），这是目前克隆 PCR 产物最简便、快捷的方法，在DNA 3'末端添加一个突出的3'-A，以便和预制接头（含有“T”粘性末端）互补配对。行使添加3'-A功能的就是Taq DNA聚合酶。

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3.3 T4多聚核苷酸激酶(T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK)和DNA连接酶(DNA Ligase)

这一结构构建完后，是否就可以通过DNA连接酶将处理后的DNA片段与接头连接，启动预文库反应呢？答案当然是否定的。人工合成的PCR引物、Linker和接头等的5′端一般都是-OH基团而不是-PO4基团，这就需要T4多聚核苷酸激酶（T4 Polynucleotide Kinase，T4 PNK）将DNA 5'端磷酸化，这样才能在DNA连接酶（DNA Ligase）作用下，使DNA链3'-OH末端和另一DNA链的5'-PO4末端发生脱水缩合反应形成磷酸二酯键，从而将通用接头、DNA片段连接成完整双链。

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3.4 高保真热启动DNA聚合酶

最终，以通用接头为引物，以上述接头连接纯化产物为模板进行PCR反应。为保证扩增产物的保真度和特异性，通常需要使用高保真热启动DNA聚合酶。具有高效3'→5'核酸外切酶活性，可以纠正DNA扩增过程中产生的错配碱基，得到高质量文库。

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四、NGS建库核心酶汇总

看到这里想必大家有个疑问：文中我们介绍了DNA聚合酶、DNA连接酶，但在实际操作中我们看到的却是诸如：T4 DNA polymerase、Klenow fragment、Taq DNA polymerase、Pfu DNA Ploymerase等字样，这又是怎么回事呢？

原来聚合酶和连接酶只是一个统称，实际应用中会根据提取菌株的不同冠以不同名称。并且，不同商业化生产厂家也会将不同聚合酶混合使用以提高反应效率。这里给大家汇总了一张表格，便于对比学习。

表1.NGS建库核心酶汇总表

注：表中列出的工作酶和商业化试剂盒名字会有出入，但同类工作酶功能相同。

结束语

相信到这里大家对NGS建库核心酶已经有一定了解，当身边小伙伴再问起时也能自信一笑、侃侃而谈。如果您觉得有帮助请点击“在看”分享，如果有问题也欢迎大家留言交流。

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常回来看看，我们下期再见。

参考文献：

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1. Gibson DG. Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments. Methods Enzymol. 2011;498:349-361. doi:10.1016/B978-0-12-385120-8.00015-2

2. Mardis ER. Next-generation sequencing platforms. Annu Rev Anal Chem (Palo Alto Calif). 2013;6:287-303. doi:10.1146/annurev-anchem-062012-092628

3. https://support./content/dam/illumina-support/courses/Sequencing_Illumina_Technology/story_html5.html?iframe

4. 贺淹才．基因工程概论：清华大学出版社，2008

5. 赵慧. PfuDNA聚合酶在毕赤酵母中的表达与功能验证[D].湖北大学,2012  

关于燃石医学

燃石医学（纳斯达克代码：BNR）成立于2014年，公司使命为“用科学守护生命之光”，专注于为肿瘤精准医疗提供具有临床价值的二代基因测序（NGS）。公司业务及研发方向主要覆盖：1）基于NGS的肿瘤患病人群检测，6年间，燃石累计检测样本超过18.5万例，在中国拥有最高的市场份额；2）基于NGS的癌症早检，目前已经进入临床验证阶段。燃石医学于2018年7月获国家药品监督管理局（NMPA）颁发的中国肿瘤NGS检测试剂盒第一证，在体外诊断领域具有里程碑式意义。实验室获得广东省临检中心颁发的“高通量测序实验室”技术审核，以及得美国CLIA和CAP实验室质量体系资质认证。公司将继续致力于开发创新可靠的NGS检测产品，推动肿瘤精准医疗领域的发展。