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肿瘤异质性是肿瘤抗原逃逸，产生耐受的重要原因，因而需要理解肿瘤异质性的复杂性，有针对性选择新的靶点，并进行新的CAR设计解决肿瘤异质性，提高CAR-T疗效，克服逃逸引起的耐药。 01 — 脑部肿瘤异质性与逃逸 肿瘤异质性是肿瘤抗原逃逸，产生耐受的重要原因，因而需要理解肿瘤异质性的复杂性，有针对性的进行CAR的设计。肿瘤细胞可塑性已被认定是肿瘤诊断和治疗复杂化的主要因素，细胞异质性表现作为脑肿瘤最显著的特征之一，也是脑胶质细胞瘤（GBM）耐药的重要因素。 在过去的二十年里，GBM基因特征研究有了很大的发展，基于关键致癌途径突变和基因表达谱差异的亚型被鉴定。GBM亚型的存在有助于解释对治疗的不同反应，一些遗传标记(如IDH 1/2、MGMT、H3K27)已被用来指导诊断和治疗。亚型之间的切换也被证明与肿瘤复发有关。 然而，脑肿瘤异质性的复杂性似乎超出了某些基因和分子亚型的差异表达。 将GBMs分类为亚型，主要集中在肿瘤整体水平上的遗传特征，从而简化了GBMs实质上的瘤内异质性。独立的研究已经阐明了肿瘤内不同解剖区域的差异基因表达模式，更确切地说，GBMs的边缘表现为代表性的神经样信号，而肿瘤的核心则表现为间充质样。 单细胞水平的基因组分析进一步阐明了GBMs的肿瘤异质性。meyer和他的同事分析了从患者来源的gbm细胞中产生肿瘤的单个克隆，确定了具有抵抗诸如TMZ等抗肿瘤治疗预先存在的克隆。 结果表明，治疗前肿瘤异质性可能与肿瘤复发的克隆选择有关。除了从GBM肿瘤中分离和鉴定亚克隆外，其他研究还使用先进的单细胞RNA测序(ScRNAseq)技术直接对原发肿瘤细胞进行测序。 所有患者使用IDH 1/2或H3K27等成熟标记物分类为不同的脑肿瘤亚群，但仍发现明显的瘤内细胞与细胞间异质性。 在多种转录芯片实验中观察到不同的变化，这些转录程序调控致癌信号、增殖、补体/免疫反应和缺氧。此外，还将scRNAseq数据与癌症基因组图谱(TCGA)建立的原始分类方案进行了比较，以区分四种GBM亚型：原神经元型、神经元性，经典型和间充质型。重要的是，TCGA亚型是从大体积肿瘤剖面中建立的，而scRNAseq亚型在类似于块状肿瘤的比较中表现为四种亚型。然而，通过单细胞RNAseq分析，所有五个被评价的肿瘤都有单独的原神经元亚型细胞，而不管肿瘤的主要亚型是什么。这种分子和细胞动态分类比群体级别的分类，能更好地解释疾病的复杂性。 有趣的是，scRNAseq还揭示了脑肿瘤异质性的非自主调节机制。IDH突变型星形细胞瘤与少突胶质细胞瘤的单细胞转录本比较，胶质细胞谱系组成无显着性差异，提示存在常见的恶性再分化；此外，更高级别的星形细胞瘤和少突胶质细胞瘤被发现与巨噬细胞在小胶质细胞上的富集有关。在GBMs中，免疫信号在不同亚型中不同，间质样肿瘤存在免疫相关基因的富集。此外，与原发性GBMs相比，复发的GBMs表现出浸润免疫细胞的改变，特别是单核细胞的减少。这些发现说明脑肿瘤在多个层面上的异质性，包括患者间、肿瘤内和肿瘤微环境内。 即使CD 19-CAR T细胞治疗B细胞恶性肿瘤成功，用CD 19抗原治疗后，完全应答的患者往往会复发。此外，在GBM的CAR T细胞临床研究中也观察到靶抗原表达中的丢失。比如IL13Rα2-CAR T治疗后复发/复发肿瘤IL13Rα2丢失/减少。同样，在一项使用EGFRvIII-CAR T细胞的研究中，有4/6的切除肿瘤的CAR后T细胞出现明显的EGFRvIII下调，推进针对脑肿瘤的CAR治疗需要采取策略，以尽量减少肿瘤异质性所引起的抗原逃逸。 02 — 开发新靶点 脑肿瘤中肿瘤抗原的异质性导致了对CAR T细胞的抗药性，表明需要扩大靶向抗原选择范围。CD 19-CAR T细胞的成功突出了理想的CAR靶点应广泛表达于不同肿瘤和瘤内细胞亚群。然而，在脑肿瘤中发现这类抗原一直是一个挑战，因为脑肿瘤细胞表达了许多由正常脑区(如CD 133、CD 44、Nestin、GFAP)所共有的标记物，而中枢神经系统中的非肿瘤靶向效应远不如人体其他部位所能忍受。因此，脑肿瘤中CAR T细胞靶点的发现需要考虑肿瘤抗原表达的广泛性和特异性。 包括IL13Rα2，EGFRvIII和HER 2，在内被用于脑肿瘤的CAR治疗靶点如下表 促红细胞生成素的肝细胞受体A2(EphA2)在GBMs中被发现过度表达，并能促进肿瘤的发生和迁移。EphA 2抑制剂在胰管腺癌小鼠模型中显示出抗肿瘤作用。E phA 2-靶向C AR T在临床前的研究中能够消除GBMs，但持续时间有限。目前在GBM患者中正在评估 EphA2-CAR T细胞，但还没有临床结果报道(NCT 02575261)。 另一种作为CAR靶标而被广泛研究的抗原是GD2。GD2在一种名为弥漫性中线胶质瘤(DMGS)的儿童脑肿瘤中表达，这种肿瘤含有组蛋白H3K27的突变。GD2-CART细胞在DMGS的临床前模型中，即使肿瘤扩散到脊髓，也能有效地控制肿瘤的生长。GD2-CAR T细胞耐受性好，在神经母细胞瘤患者中表现出一定的临床活性，但其临床抗肿瘤疗效和抗DMGS的安全性有待探讨。 B7-H3(CD276)是一种免疫检查点分子，负调控T细胞活化，还与肿瘤的迁移和侵袭有关。对TCGA数据库的分析表明B7-H3的表达上调，特别是在恶性的胶质瘤中。Majzner和他的同事开发了一种针对多种类型儿童肿瘤(包括髓母细胞瘤)的CAR靶向B7-H3，表明B7-H3-CAR t细胞可能在临床上应用于某些类型的脑肿瘤。 另一项研究筛选了一组代表不同分子亚型的初级gbm样本，并鉴定出硫酸软骨素硫酸蛋白多糖4(CSPG 4，也称为神经元胶质抗原2，NG2)在这些肿瘤中广泛表达。此外，CSPG4的表达可由免疫刺激的细胞因子TNFα诱导，而CSPG 4是在CART细胞抗肿瘤反应中产生的，从而使肿瘤抗原逃逸的可能性较小。 胶质母细胞瘤包含具有自我更新和肿瘤再生特性的特定亚群，研究显示了这些GBM干细胞（GSCS）介导抵抗放疗和化疗的耐受性。消除GSCS的能力对于GBM靶向治疗是至关重要，以最小化肿瘤复发。一方面，使用该策略从切除的GBMS中富集和扩增肿瘤球，个不同的研究证明了靶向IL13Ra2、HER2和EGFRVIII的CART细胞能够消除分化的GBM细胞以及GSCs，表明CAR介导的细胞毒性不依赖于GBM细胞。另一方面，已经针对CD133开发了CART细胞，CD133是包括GSCs的癌症干细胞的表面标记之一。T细胞在临床前表现出对患者来源的GSCS的细胞毒性，以及对肝、胰和结肠肿瘤患者的抗肿瘤反应。然而，CD 133也在神经干细胞中表达，从而增加了应用CD 133-CARs治疗GBM患者的安全性。 此外，预期适用于T细胞靶向的脑肿瘤抗原池预期会扩大到膜相关蛋白之外。Chheda和同事发现了来自H3.3K27.刺激HLA-A2的DIPG患者的共享新抗原，突变肽的CD8T细胞产生TCR克隆，当在T细胞上表达时，该TCR克隆介导对含有相同突变的肿瘤细胞的细胞毒性。此外，最近的一些研究已经开发了抗可溶性蛋白的CAR 表明了靶向脑肿瘤特异性分泌因子的潜力。 这些努力扩大了GBM和其他脑肿瘤靶点的识别范围，为CART细胞治疗的发展提供了新的选择。当然，关键的基准将是在精心设计的临床试验中确定这些新抗原的安全性。一旦安全建立，就有巨大的机会利用针对这些抗原中一种或几种抗原的CART细胞来对付广泛的脑肿瘤以及更广泛的瘤内细胞亚群。同时，CART治疗GSCs的能力可进一步降低肿瘤复发。 03 — 提高CAR设计解决抗原逃逸问题 尽管出现了针对脑肿瘤的直接CART细胞疗法的新靶点，复发性肿瘤可能仍然能够通过下调靶向抗原或出现抗原阴性克隆而绕过单价CART细胞。因此，一项针对抗原逃逸的策略是延长常规的单靶向CAR设计，以涵盖双特异性靶向结构域，从而识别两种足以触发T细胞活化的抗原之一。这些“或门控”的设计可能会增加非肿瘤靶向潜力的安全性问题。双特异性CARS的靶标一般是从肿瘤特异性抗原库中筛选出来的，或者是在确定了一价CAR靶向安全性之后。其中一个例子是CD22，另一种用于正常和恶性b细胞的细胞表面标记物CD19.和CD 22单靶点的CART细胞在b-ALL患者中耐受性较好，CD 19/CD 22双特异性Car t细胞目前正在多个临床试验中进行研究(nct 03448393，nct 03233854，nct 03241940)。此外，另一种b细胞表面标记CD 20与CD 19联合产生了一种双特异性car，在临床前的模型中可以根除表达这两种抗原的淋巴瘤。 同样，针对 GBMS 的双特异性 CARS 的设计也集中在临床前和临床研究中的抗原上，包括 IL 13 Rα2 、 HER2 和 EphA 2 。Hedge和他的同事用表达两种抗原的原位 GBM 异种移植模型开发了一种双特异性靶向 IL 13 Rα2 和 HER 2. 的 CAR ，作者表明双特异性 CAR 能够控制肿瘤约 1 个月，而单靶向 CAR 治疗不会导致肿瘤因抗原逃逸而导致肿瘤消退。这种方法进一步扩展到针对 EphA2. 的第三个靶向域，然而，在这些 CAR 的所有临床前研究中都发现肿瘤复发，所有靶向抗原都丢失了，这些研究提出了最小抗原逃逸的问题。 双或三特定CAR的最佳结构设计仍在抗原的抗体结合，或者配体结合区结构域。目前,已经有两种不同的结构设计,针对“OR‐gate”目标战略进行了测试。“串联”设计提出了每个单链可变片段(scFv)的重链和轻链顺序连接，而“回路”设计类似于结构二价抗体。不同“ORgate”的比较设计是在 CD 19 / CD 22 双特异性的背景下进行，显示“回路”优于“串联”在介导抗肿瘤反应。没有类似的研究靶向其它抗原，但结果来自CD19/CD22的CAR设计表明，CAR分子(二价设计、接头长度和scFv序列)对CAR产品的效力至关重要。 优化的CAR设计的选择需要广泛的功能评估，通过工程T细胞识别单个或双重目标和/或计算模拟热力学CAR抗原相互作用。
肿瘤特异性抗原与新型 CAR 设计的发展对抗脑肿瘤有了重大进展。尽管已经显示了组合目标,在解决肿瘤异质性方面的前景，在优化目标抗原的数量和组合方面，目前仍在观察。大部分不确定性来自于缺乏对细胞免疫后肿瘤动态变化的再识别攻击，因此，揭示CAR治疗后脑肿瘤的演化，尤其是肿瘤内细胞亚群的单细胞图谱改变，将为指导CAR T细胞治疗和克服肿瘤异质性提供有价值的信息。 主要参考文献 David Akhavan，Immunological Reviews. 2019;290:60–84. Kawalekar OU. Immunity.2016;44(2):380‐390. |
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