lncRNA机制：与mRNA互补结合抑制翻译（10.679）

A Novel AR Translational Regulator lncRNA LBCS Inhibits Castration Resistance Of Prostate Cancer

一种新型AR翻译调节因子lncRNA-LBCS抑制前列腺癌去势抵抗

期刊：Molecular Cancer     影响因子：10.679

发表单位：中山大学孙逸仙纪念医院泌尿外科

导 读

先前的文章中我们介绍了lncRNA招募激酶促进靶蛋白磷酸化的机制“lncRNA结合蛋白调控机制文章（11.878）”。本篇文章继续探讨lncRNA的的机制，在我们公司做过lncRNA测序的老师，会发现lncRNA的靶基因调控机制，trans机制中有差异mRNA与lncRNA结合位点，自由能预测。老师可能不理解怎么使用。今天他来了，这篇文章讲解了lncRNA与靶基因mRNA结合抑制其翻译，达到调控的目的。

摘  要

 

背景：进展到去势抵抗状态是前列腺癌(PCa)患者死亡的主要原因。雄激素受体(AR)信号传导在去势抗性前列腺癌(CRPC)的进展中起着核心作用，因此了解低雄激素环境下AR激活的机制对于发现治疗CRPC的新途径至关重要。

方法：首先，我们通过转录组微阵列来探索CRPC相关的lncRNA。在三个独立的大规模队列中分析lnc-LBCS的表达和临床特征。通过体外功能获得和丧失实验，进一步研究了lnc-LBCS的功能作用和机制。

结果：Lnc-LBCS在CRPC细胞系和组织中表达较低。LBCS下调与PCa患者Gleason评分高、T分期及预后不良相关。LBCS过表达减少，而LBCS敲低增加，在雄激素消融或AR阻断条件下前列腺癌细胞的去势抗性特征。此外，LBCS敲低足以在没有雄激素的情况下通过提高AR蛋白的翻译来激活AR信号转导。在机制上，LBCS直接与hnRNPK相互作用，通过与hnRNPK和AR mRNA形成复合物来抑制AR翻译效率。

结论：LNC-LBCS作为一种新型的AR翻译调节因子，通过与hnRNPK相互作用抑制前列腺癌的去势抵抗。这为lncRNA介导的AR激活对CRPC的调节提供了新的见解，LBCS-hnRNPK-AR轴为CRPC的治疗提供了一种有前景的方法。

结 果

1    在CRPC细胞中，LBCS明显下调

在我们之前的研究中，我们报道了LNCaP细胞及其两个抗去势亚系LNCaP-AI和LNCaP-Bic中不同表达的lncRNA。我们之前发现HOXD-AS1在CRPC细胞中过表达，在本研究中我们关注下调的lncRNAs。我们发现了一种名为LBCS的新型lncRNA，它是以前报道的微阵列结果中CRPC细胞中下调最多的lncRNA之一（通过表达谱芯片、lncRNA测序找lncRNA）。最近的研究发现，LBCS通过诱导hnRNPK-EZH2复合物抑制SOX2的表达，从而抑制膀胱癌干细胞的自我更新、化疗抗性和肿瘤启动（这个lnc在膀胱癌中研究过，本实验中没有）。然而，LBCS在PCa进展中的生物学功能和机制尚不清楚。然后我们通过实时定量qPCR证实LBCS是CRPC细胞系中下调最多的lncRNA之一(图1A)。此外，我们观察到随着雄激素消融时间的延长，LBCS的表达逐渐降低(图1B)，与LNCaP细胞相比，LBCS在雄激素非依赖性细胞22Rv1中的表达也较低(图1C)。

2    LBCS与PCa的临床特征和良好的预后相关

为了研究LBCS是否参与临床PCa的进程，我们检测并分析了三组独立的PCa样本中LBCS的表达。首先，我们用原位杂交(ISH)方法分析了它在包含130个PCa和32个良性前列腺肥大(BPH)组织的队列1中的表达。我们发现，与BPH组织相比，PCa中LBCS的表达显着降低(图1D-E)。有趣的是，CRPC患者中与激素敏感型前列腺癌(HSPC)患者相比(图1D，F)，在T3-4肿瘤中与T1-2相比(图1G)，在Gleason评分为8-10的组织中与6-7相比(图1H)，LBCS的表达也明显下调。进一步分析显示LBCS表达与队列1中的T分期和Gleason评分密切相关。为了进一步证实LBCS在PCa患者中的临床意义，我们分析了来自肿瘤基因组图谱(TCGA)的大规模RNA-seq数据集和相应的临床信息。共纳入374例PCa和52例BPH组织。我们发现，与BPH组织相比，PCa中LBCS的表达显着下调(图1L)。这些数据表明，LBCS可能在PCa的引发和进展中起关键作用。（自己收集样品及公共数据分析lnc的表达差异）

然后我们探讨LBCS的表达是否与PCa患者的预后相关。队列1的Kaplan-Meier生存分析表明，低LBCS表达的PCa患者的生化无复发生存期(BRFS)和无进展生存期(PFS)明显缩短(分别为P=0.0012，0.0025，图1M-N)。多变量分析显示，LBCS表达是PCa患者BRFS的独立预后因素(P=0.04)，而不是PFS。此外，通过GEPIA分析TCGA谱的存活率，我们观察到LBCS的高表达与更长的总存活率和无病存活率相关，尽管它没有统计学意义。这些发现清楚地证明了LBCS作为PCa预后良好的标志物的潜力。（看lnc的生存曲线）

3    LBCS恢复CRPC细胞的去势敏感性

为了探讨LBCS在PCa进展中的生物学作用，我们首先通过慢病毒稳定地过表达或敲低PCa细胞中LBCS的表达。在去势条件下，LBCS过表达降低了去势抗性LNCaP-Bic和LNCaP-AI在An-drogen消融培养基中的增殖，并且，LBCS的消耗促进雄激素敏感的LNCaP细胞的增殖。与细胞生长结果一致的是，与对照细胞相比，过表达的LBCS形成的CRPC细胞集落明显较少且较小，而LBCS敲低，LNCaP细胞形成的集落较多且较大。此外，我们发现在LNCaP-AI和LNCaP-Bic细胞中，LBCS过表达显著地增加了G0/G1期的细胞数量，而减少了S期的细胞数量。相反，LBCS沉默显著增加了LNCaP细胞中S期的细胞数量，流式细胞术检测到这一点。这些数据表明，在去雄激素条件下，LBCS抑制PCa细胞的细胞活性。（过表达敲低lnc，查看细胞的增殖凋亡等）

4    LBCS抑制AR蛋白翻译并抑制AR信号激活

考虑到LBCS在功能上影响PCa细胞的去势抗性，我们随后探讨了LBCS是否调节AR信号通路(AR通路是该疾病模型的核心重要通路，与这个基因/通路关联)。我们发现，在CRPC细胞中，LBCS过表达时，包括PSA，TMPRSS2和OPRK1在内的AR下游基因的表达显著下调，但AR的mRNA表达没有明显变化（靶基因下调，AR的表达量没有改变，如果是做RNAseq找靶基因，要特别注意了，特别关注的基因没有变化，要验证蛋白水平有没有变，靶基因有没有变）。相反，这些AR靶点在LBCS敲低的LNCaP细胞中上调。有趣的是，我们发现在LBCS过表达的CRPC细胞中AR蛋白及其靶基因下调，而通过Western blotting在LBCS较少的LNCaP细胞中上调。此外，我们发现LBCS过表达的 CRPC细胞培养基的PSA水平显著降低，而LBCS敲低的LNCaP细胞的PSA水平显著增加，如化学发光检测到的。为了进一步验证LBCS和AR之间的关系，我们用原位杂交（ISH）和免疫组化(IHC)评估了18例前列腺癌组织中LBCS和AR的表达。癌组织中LBCS和AR蛋白的表达呈负相关(P=0.002，R=−0.676)。接下来，我们研究了LBCS是如何在蛋白质水平上调节AR表达的。

我们用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞。我们发现MG132显著增加了AR蛋白水平，证实成功阻断了蛋白酶体介导的蛋白质降解。此外，LBCS下调增加了对照处理细胞中的AR蛋白水平，而在MG132预处理的细胞中显示出更显著的差异。另一方面，与对照处理的细胞相比，MG132处理消除了LBCS过表达对AR蛋白的抑制作用。这些数据表明LBCS抑制AR翻译而不是蛋白酶体介导的AR降解。（mRNA没变，蛋白量改变，看AR的降解过程是否有改变，方便与泛素化复合物等关联）

最后，为了检查LBCS是否影响AR泛素化，一系列实验证实LBCS不影响AR蛋白的泛素化。我们的结果表明LBCS的敲低促进AR蛋白翻译，而不是泛素化或蛋白酶体介导的降解。此外，我们进一步验证敲低LBCS是否直接激活AR信号。我们使用位点特异性引物对几个已知的AR靶基因进行抗AR抗体的CHIP-qPCR。我们的数据证实，LBCS下调确实增加了对PSA，TMPRSS2和OPRK1启动子的AR和Pol-II招募，导致AR信号激活。（如何确定通路激活，通过的基因改变，靶基因改变。如何确定某个基因激活，看其靶点是否改变）

我们的数据表明，LBCS是AR蛋白翻译和AR信号激活的新型抑制因子。

5    LBCS与AR mRNA直接相互作用

LncRNA的亚细胞定位与其生物学功能密切相关。细胞分级分析和RNA荧光原位杂交(RNA FISH)显示，LBCS在PCa细胞的细胞核和细胞质中均有分布，但主要分布在细胞质中(下图 A-B)，提示LBCS可能具有转录后调节功能（确定lnc定位，方便选择调控机制）。以往的研究表明，翻译调节元件主要位于5‘UTR区域。为了解决这个问题，我们通过克隆全长(FL)5’-UTR和5’-UTR和3’-UTR的不同片段作为对照，对荧光素酶载体进行了荧光素酶分析。有趣的是，我们发现当与psiCHECK2-5’-UTR共转染LBCS时，荧光素酶活性显著降低，而不是含有3’-UTR的载体(下图 C-D)。此外，我们发现LBCS显著抑制5’-UTR的 282-620区域的荧光素酶活性，但不抑制1-300，620-871和864-1115区域的荧光素酶活性(下图 C)。通过序列预测，我们发现了三个潜在的LBCS-AR结合区(称为AR1-3)。为了确认精确的结合位点，使用体外合成的LBCS和AR 5’-UTR RNA区域进行荧光共振能量转移(FRET)。在460 nm激发下，LBCS(164-184 nt)/AR组与对照RNA/AR组相比，580 nm处的释放增加，而520 nm处的信号降低，但其他组没有。这些数据表明，LBCS 164-184 nt区域直接与AR(Ar1)的5’-UTR 545-565 nt区域相互作用，而不与其他区域(Ar2，Ar3)相互作用。此外，我们通过RNA纯化实验进行了RNA分离，然后通过实时荧光定量qPCR检测了LNCaP细胞中特异性AR mRNA区域的富集。有趣的是，我们发现与阴性对照LacZ探针相比，含有AR1区域的5’-UTR被LBCS探针富集，而不是其他区域(下图 J)。同时，我们通过定点突变产生了含有突变体AR1区域的荧光素酶载体(下图 K)。我们发现LBCS显着抑制野生型AR1区的荧光素酶活性，但不抑制突变区的荧光素酶活性(下图 L)。（推测AR的翻译过程受阻，猜测是lnc与mRNA结合，导致其不能正常翻译）

综上所述，我们的结果支持LBCS直接与AR mRNA相互作用来抑制其翻译。

6    LBCS结合并募集hnRNPK与AR mRNA以抑制PCa中的AR翻译

LncRNA通常通过与蛋白质结合来发挥其调节功能（前面的机制略简单，增加lncRNA与蛋白结合发挥调控作用）。因此，我们应用RNApull-down试验进一步阐明了PCa细胞中LBCS的作用机制。银染色显示一条55kD左右的明显差异带，质谱鉴定为异质核核糖核蛋白K(HnRNPK)(下图 A)。此外，我们使用western blotting证实了LBCS与hnRNPK的相互作用(下图 B)。这一结果与我们最近在膀胱癌研究中的发现是一致的（从图中可以看出，一个lnc能结合很多蛋白，当然我们找有差异的）。有趣的是，先前的一份报告发现hnRNPK是AR翻译的关键抑制因子，并且hnRNPK和AR在前列腺癌中的表达呈负相关。然而，hnRNPK如何与AR结合的详细机制尚不清楚。为了研究LBCS是否作为hnRNPK-AR相互作用的支架，我们进行了RNA免疫沉淀(RIP)，发现hnRNPK抗体与IgG相比，LBCS和AR mRNA显著富集(下图 C)。

此外，与阴性对照细胞相比，在LBCS下调的LNCaP和LNCaP-AI细胞中，hnRNPK抗体对AR mRNA的富集明显减少(下图 D)，表明AR mRNA和hnRNPK之间的相互作用依赖于LBCS。此外，我们进一步证实LBCS对AR的抑制是通过western blotting以hnRNPK依赖的方式进行的(下图 E-F)。我们观察到LBCS和hnRNPK的联合敲低比单独敲低LBCS或敲低hnRNPK更显著地增加AR水平(图5E)。相反，LBCS和hnRNPK的联合过表达显示出比单独过表达LBCS或过表达hnRNPK表现出更强的AR抑制(下图 F)。有趣的是，hnRNPK的敲低完全消除了LBCS介导的AR蛋白的抑制作用(下图 F)。在每个实验中检测到代表AR信号变化的PSA，表明AR通路的激活是由LBCS和hnRNPK介导的。

总之，这些结果表明LBCS直接与hnRNPK相互作用，并募集它来抑制PCa中的AR翻译。

讨 论

 

新的研究表明，lncRNAs在肿瘤发生和癌症药物耐药中起着重要的调节作用。在本研究中，我们首先证明了lncRNA LBCS在PCa和CRPC细胞和肿瘤组织中显著下调，并与肿瘤分期、Gleason评分和预后相关。此外，本文提出了一种新的模式，其中LBCS通过诱导hnRNPK抑制AR翻译来抑制PCa的去势抵抗，从而减弱PCa的进展和去势抵抗(上图 G)。这些发现表明LBCS在PCa进展和去势抵抗中起着肿瘤抑制的作用，并可被认为是PCa潜在的预后生物标志物和治疗靶点，并且LBCS-hnRNPK-AR轴为CRPC的治疗提供了新的方向。

看了本文，可以学到以下几条：

1. 通过lncRNA高通量测序/芯片找差异lnc，结合公共数据如（生存曲线）选中候选lnc, 结合qPCR等确定研究的lnc。

2. 寻找lncRNA的靶标时，有很强的主观性。有理由相信同一个lnc在细胞中可能同时发挥多种作用，多种机制。与重要的基因/复合物/通路关联，做出机制的可能性更大。

3. 关注的基因，没有差异，不要慌。看看蛋白是否有改变，如果蛋白没有改变，看看磷酸化，甲基化是否有改变。如果蛋白有改变，考虑蛋白的翻译过程，降解过程异常。考虑lnc在这一块的作用。