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相对于CAR-T细胞在血液型肿瘤取得的丰硕成果，CAR-T细胞疗法在面对大多数难治和复发的实体肿瘤时疗效不佳，只有少量成功的案例。因此，如何增强CAR-T细胞对实体肿瘤的浸润、并增强其在免疫抑制的肿瘤微环境里的活力，是用免疫细胞疗法清除实体肿瘤的关键。 2019年9月11日，来自中山大学中山医学院的张辉教授团队在Nature Communications杂志上发表题为Engineered triple inhibitory receptor resistance improves anti-tumor CAR-T cell performance via CD56的研究报告。作者利用小鼠卵巢癌以及淋巴瘤模型，确定了PD-1、Tim-3、Lag-3三个抑制性受体同时敲减的CAR-T细胞抗肿瘤的活性显著增强，而CD56介导的CAR-T细胞之间的同质性相互作用（Homophilic Interaction）正是CAR-T细胞抗肿瘤功能增强的关键因素。 在该项研究中，作者针对耗竭状态的T细胞高表达多种免疫抑制性受体，尤其是PD-1，Tim-3，Lag-3，提出假设：在CAR-T细胞中同时敲减这三个抑制性受体是否可增强CAR-T细胞的抗肿瘤效应？为此，他们利用免疫缺陷型小鼠皮下接种Her2阳性卵巢癌细胞（SKOV3）或者CD19阳性淋巴瘤细胞（Raji），分别构建了两种不同靶点的肿瘤模型，并分别回输不同抑制性受体敲减的CAR-T细胞。对肿瘤中浸润CAR-T细胞表型的分析以及肿瘤体积的测量结果显示三个抑制性受体同时敲减的CAR-T细胞（PTL-Her2-CAR-T、PTL-CD19-CAR-T）的抗肿瘤活性显著强于不敲减抑制性受体、单独敲减PD-1或者的同时敲减PD-1和Lag-3的CAR-T细胞（Her2-CAR-T、PD-1-Her2-CAR-T、PL-Her2-CAR-T）。 为进一步探讨PTL-Her2-CAR-T细胞杀伤功能增强的机制，作者分析了回输不同CAR-T细胞的肿瘤组织切片，发现PTL-Her2-CAR-T细胞治疗组肿瘤中浸润了大量免疫细胞，且分泌的IFN-γ明显增加，而其他组均未检测到免疫细胞大量浸润的现象。尤其明显的是，PTL-Her2-CAR-T细胞之间相互很靠近，大量聚集在肿瘤坏死组织与正常组织分界的区域，且分泌的IFN-γ明显高于其他实验组（图1）。 由此，作者推测PTL-Her2-CAR-T细胞抗肿瘤活性的显著增强及在肿瘤组织中大量聚集，可能与其表观遗传学的变化相关。他们对从肿瘤组织中分离出浸润的CAR-T细胞并利用转录组芯片进行检测。对细胞趋化以及黏附因子基因富集分析结果显示，肿瘤浸润的PTL-Her2-CAR-T细胞CXCL9、CXCL10、CXCL12明显增多，同时效应分子IFN-γ和TNF-α，和抗凋亡因子Bcl-2表达也增强。尤其显著的是，CD56的表达大量增加，进一步的肿瘤组织切片免疫荧光结果也证实，CD56在浸润肿瘤组织的PTL-Her2-CAR-T细胞的表达也明显升高。ATAC-seq 实验进一步发现肿瘤浸润的PTL-Her2-CAR-T细胞中的上述正向功能相关的基因染色质开放程度更高。通过体外功能学实验，他们确定敲减CD56能够显著下调PTL-Her-CAR-T细胞杀伤靶细胞的能力。 CD56长期作为人的NK细胞的标记分子，但小鼠NK细胞不表达，其在免疫系统的功能一直不太清楚。CD56（又名NCAM）在神经细胞上有重要的生理功能，不同细胞上的CD56通过其Ig2和Ig3结构域结合，互为配受体，即同质性相互作用（Homophilic Interaction）。作者首先通过检测过表达CD56对Her2-CAR-T细胞抗肿瘤活性的增强，确定了CD56对CAR-T细胞抗肿瘤活性的正向调节作用，并推测CD56通过介导的细胞间同质性相互作用，增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性。通过一些检测膜蛋白相互作用的实验手段譬如FRET方法和LIPSTIC 方法，作者证明过表达CD56的CAR-T细胞间具备同质性相互作用。进一步动物模型实验结果显示，阻止CD56-CD56同质性相互作用的特异性竞争短肽可有效减弱PTL-Her2-CAR-T细胞的抗肿瘤活性，从而证实CD56介导的同质性相互作用是介导CAR-T细胞抗肿瘤功能增强的关键因素。这项工作也从一个特殊的角度，揭示了CD56分子在免疫细胞表面的功能（图2）。 为探索CAR-T细胞在小鼠体内的持续维持功能，作者还开展了再接种肿瘤（Re-challenge）实验。实验结果显示，PTL-Her2-CAR-T细胞治疗组的小鼠均能够拮抗第二次接种的同种肿瘤细胞，而其他Her2-CAR-T细胞治疗组（Her2-CAR-T、PD-1-Her2-CAR-T、PL-Her2-CAR-T）小鼠均出现肿瘤复发的情况。在回输后4周，作者在PTL-Her2-CAR-T细胞治疗组小鼠脾脏中检测的CAR-T细胞最多，且其中记忆表型（CD62L和CD127双阳性）的CAR-T细胞比例也显著高于其他组。该实验表明，同时敲减PD-1、Tim-3、Lag-3三个抑制性受体还能让CAR-T细胞在体内的停留时间延长，可用于监控残余肿瘤细胞和残余慢性病毒储藏库。 除PD-1、Tim-3、Lag-3三个抑制性受体外，不同的肿瘤或慢性病毒感染状态下的T细胞也可能高表达Tigit、CD160、CD96等耗竭相关抑制性受体，通过分析患者T细胞抑制性受体的表达丰度，研发“抑制性受体精准敲减”的CAR-T细胞以及其他诱导CD56高表达的技术（过表达或药物诱导表达）为解决CAR-T细胞技术对实体肿瘤无效提供了新颖的改进策略，有望在临床上广泛应用于清除各种实体肿瘤及慢性病毒储藏库。 原文链接： https://www./articles/s41467-019-11893-4.pdf 制版人：珂 |
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