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连续水了好几期，实在抱歉。 今天终于能写点东西了。 常 规 HE 染 色 HE染色是病理实验中最用的一种基础染色方法。染色后可清晰地反映出组织结构、组织类型、细胞层次等，在此不赘述。 俗话说，漂亮的染色千篇一律，糟糕的染色总能丑出自己的特色。为了让大家染好，小编手敲了下面的内容，希望能助力一二。有关于组织固定、脱水、透明、包埋和制片的内容，小编会穿插在内容中。 Q1：HE染色最常见的红蓝失调 答： （1）偏蓝色：苏木素染色过深，分化不够；伊红试剂过期；伊红染色时间太短，分化过度。 （2）偏红色：苏木素染色过浅，分化过度；组织固定不佳，细胞核不着色；脱蜡不彻底，苏木素染不上；苏木素氧化成熟不够；伊红染色过深，分化不足。 Q2：HE染色后出现的大白色斑块或斑点 答：脱蜡前烤片温度偏低，时间过短，蜡未完全融化；切片在脱蜡溶剂中停留时间过短；脱蜡溶剂使用太久，得更新。 Q3：细胞核染色过浅，颜色暗淡 答：切片在苏木素染液中停留过短，或苏木素过度氧化失效，或分化时间太长。对策：重新染色。将组织切片放入0.01%氢氧化钠、0.5%氨水、饱和的碳酸氢钠溶液、乙醇溶液，每个3-5min即可，接着重新染色。可以适当地组织的嗜碱性以增强核染色，如Zenker液固定的切片可放入5%碳酸氢钠溶液中3h，自来水冲洗5-10min染色，或Bouin液固定的切片可放入5%碳酸氢钠溶液中1h，自来水冲洗10min染色。 Q4：细胞核染色过深，胞浆着蓝色 答：切片在苏木素染液中停留过长；或切片太厚；或分化时间太短。这种情况首先镜下看看切片厚度(最佳厚度1-2层细胞核)，要么重新染色，要么重新制片。 Q5：细胞核呈棕红色改变 答：苏木素染液过度氧化；或苏木素染色后反蓝不足导致。应该立即更换苏木素染色液。或在流动自来水(一般自来水PH7.5-7.8)，或在稀释的氨水溶液，或在0.2%碳酸氢钠中适当浸泡，这些步骤均可一定程度地加强苏木素染色后的反蓝效果。 Q6：伊红染色较淡 答：伊红的PH改变了(PH可能已大于5)；或反蓝液体未漂洗干净，残留后影响胞浆嗜酸性染色；或者切片太薄并且在随后的脱水步骤停留过久。对策：检查伊红染色液PH，可采用乙酸调至4.6-5.0。根据以上提示，调整实验步骤。 Q7：染色时切片脱落，怎么办？ 答： （1）血栓、坏死或硬度较大的组织本身在染色时就极易脱落，应小心操作。 （2）组织脱水、透明不佳，石蜡未完全渗入，脱蜡时组织收缩，复水时组织又吸水膨胀，造成脱片；还可能是组织脱水、透明过度，且浸蜡温度过高，导致组织变硬变脆，既不容易切片也极易在染色过程中脱片。对策：发脆发硬的组织可用棉签蘸5%氨水或2%冰醋酸溶液涂抹在组织表面10-15秒。然后精修出组织面，放入冰水混合物中泡1min，再切片。 （3）切片太厚；切片破碎，不整齐；展片时水温过低，展片不充分导致组织与玻片贴合不紧密；烤片时间和温度过短过低，或过久过高，一般使用防脱玻片烤片仅需30min即可。 （4）染色前入水步骤不够，组织吸水后快速膨胀，导致脱片；染色过程中漂洗粗暴，振荡过度；反蓝时间太久，反蓝液碱性过强，可以采用自来水反蓝，一般自来水PH7.5-7.8，效果很好。 （5）1%盐酸乙醇分化时脱片。分化的原理是利用盐酸电离出的氢离子，改变组织表面电荷，使得吸附的染料脱落。由此看来，乙醇的作用并不大。并且分化液中的乙醇会使组织快速脱水而收缩，在随后漂洗时组织又快速吸水膨胀，极易脱片。因此完全可以改用1%盐酸水溶液作为分化液。 Q8：切片染色不均匀，有片状的弱着色区存在 答： （1）取材时组织太厚，固定过久，导致深部组织固定不佳，而表浅组织过度固定，而透明、脱水、浸蜡均是如此，这样在后期染色时就会出现染色不均匀。应该将厚的组织剖开固定。 （2）制片过程有问题，切片厚薄不一，或者有刀痕，或组织与玻片间存在气泡。同一张切片厚薄不一，一般都是在制片时，刀片固定不佳或刀片钝或刀片与组织角度不佳（一般最佳角度为5°） （3）脱蜡前未烘烤，脱蜡时间过短或脱蜡液使用过久，导致脱蜡不彻底。 （4）染色液过少，着色不均匀；或染色时部分组织干涸而另一部分湿润，这样会导致组织吸附染料的能力不一。 （5）分化不当。 Q9：成片的染色模糊不清，灰染 答： （1）组织未及时固定，部分自溶；或固定不佳，深部组织未处理到。这种只能重新固定了。 （2）尽管乙醇也是一种固定液，但尽量少用或不用，因为其会导致组织发硬变脆，染色效果不好。 （3）包埋时蜡的温度过高，或切片后烤片时间和温度过久过高都不好，可能会导致无法染色。 （4）脱蜡不彻底；染料有问题；分化过度导致的颜色变淡，镜下组织界限不清；染完后的脱水和透明不佳，水雾残留在组织上。 （5）通风窗中（防止空气中的水雾），戴口罩操作封片（减少哈气带来的水雾）。 Q10：不管怎么操作，始终无法染色或淡染 答：这种情况一般因为组织固定时采用了酸性甲醛；或者组织在甲醛中浸泡时间太长；或者久置的甲醛变性分解为甲酸。补救：防患于未然，要么使用新鲜的中性甲醛固定，要么在存放的甲醛中加一点碳酸钠中和甲酸。对于已经固定的组织可考虑再次固定。对于已经制出的片子，染色前采用5%重铬酸钾溶液浸泡半小时以上，然后自来水漂洗5min，可改善染色。也可以将切片放入3%硫酸铁铵溶液中，补充染色媒介，增强苏木素与组织的亲和力（苏木素染色必须要媒介才能染上，单纯的苏木素与组织的亲和力很弱）。 Q11：HE染色后镜下看到很多小黑点或小水珠似的物质 答：脱水过程不彻底，造成的水雾残留；中性树胶封片前，组织切片已经干涸，此时树胶不容易渗入组织间，容易残留细小的气泡。此时应该用二甲苯彻底脱去封片胶，并重新封片。 Q12：妙用冰醋酸，增强HE染色效果 答：伊红溶液中加入少量的冰醋酸（一般小于10%就行），可改变组织等电点，促进伊红与胞浆蛋白质结合，其本身不参与染色的反应。当苏木素染色效能极高，很短时间就导致核浆共染时，可适当地添加冰醋酸（一般不超过2%），抑制苏木素染色效能，方便控制染色时间，同时也能提高苏木素染色的清晰度。 Q13：醇性HE染液与水溶性染液选哪个 答：都行，染色效果都很好，但细节上存在不同。醇性染色液体挥发较快，不易掌握，但是染色效果很好，分辨度高。水溶性染色比较自由，易操作，分辨度相对低一点，但是也能满足需要。 Q14：染色前烤片温度、时间对HE染色的影响 答：肯定有影响。最佳时间是60℃，25min即可。可活动至60-75℃，25-30min。 Q15：可以把HE切片洗去做其他染色吗 答：可以，这种情况一般适用于组织量较少，或较珍贵时操作。脱色步骤：在烤片台上加热HE切片，用镊子轻轻移除盖玻片，然后立刻将组织切片放入新鲜的二甲苯（1/2/3，各8min），以充分脱去封片剂。然后梯度乙醇下行（100%、100%、95%、80%）各5min，接着放入自来水中浸泡2min。随后将切片分别放入0.01%氢氧化钠、0.5%氨水、饱和的碳酸氢钠溶液、乙醇溶液，每个3-5min即可。然后采用双蒸水漂洗。并进行其它染色。一定要轻慢小心，防止脱片。 Q16：苏木素的配制和使用技巧 答：现在有商用的HE染色液卖，但是质量参差不齐。如果课题组较大，完全可以自己配制，效果也挺好。配制为乙酸浓度5%-7.5%和盐酸浓度为0.5%-1%的苏木素溶液放置一周，即可完全成熟，染色效果好，氧化膜和结晶都很少（一般苏木素中酸度越低越容易产生氧化膜和结晶，这也是提示更换苏木素的标志之一）。 最后总结一下，HE染色时，切片经苏木素染色细胞核以后，采用盐酸乙醇分化（也可采用盐酸水溶液），伊红染色后经过适当地水洗，需用70%乙醇分化。在整个实验过程中，小编觉得分化是最为关键的步骤，希望大家能处理好这一步。 完结！撒花！ |
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