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本文作者： 由凯 李梦云 薛辛东 作者单位： 中国医科大学附属盛新生儿科 本文编辑： 高飞 推文编辑： 李永军 【摘要】 目的 探讨高氧致新生大鼠支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）发生过程中肺组织细胞周期蛋白cyclinA2及其抑制因子p21对肺泡发育的影响。 方法 80只新生大鼠随机分为模型组(FiO2＝80%-85%)和对照组(FiO2＝21%)。采用辐射状肺泡计数（axial acinar count，RAC）和肺泡间隔厚度评价肺泡发育程度；免疫组织化学和Western blot检测cyclinA2和 p21分布及表达。 结果 RAC从3d开始低于对照组，肺泡间隔厚度从7d开始高于对照组(P＜0.05 )；模型组p21蛋白表达于3d开始增加，14d达峰，并且持续至21d,而模型组cyclinA2蛋白表达于14d、21d高于对照组（P＜0.05）；模型组中RAC与p21蛋白表达与呈负相关(r=-0.5966，P＜0.01)，与cyclinA2无相关性(r=0.7276，P＞0.05)；对照组RAC与p21无相关性（r=-0.2929，P＞0.05）,与cyclinA2呈正相关（r=0.8476，P＜0.01）；模型组和对照组肺泡间隔厚度均与p21呈正相关(r=0.4291，P＜0.05；r=0.4447，P＜0.05)，与 cyclinA2呈负相关(r=-0.6814，P＜0.01；r=-0.7636，P＜0.01）。 结论 暴露高氧新生鼠肺组织细胞周期调控蛋白cyclinA2及其抑制因子p21表达失衡，可能是干扰BPD肺泡发育的相关因素之一。 【关键词】 cyclinA2；p21；肺泡化障碍；高氧；新生鼠 基金项目：国家自然科学青年基金（81501292）;中国博士后基金面上项目（ 2017M611285） Expression of cyclin A2 and its inhibitory factor in BPD neonatal rats and its effect on alveolar development 【Abstract】 Objective To investigate the effects of cyclinA2 and its inhibitor p21 on alveolar development in bronchopulmonary dysplasia (BPD) neonatal rats. Methods Eighty newborn rats were randomly divided into a model group (FiO2=80%-85%) and a control group (FiO2=21%). The degree of alveolar development was evaluated by radial alveolar count (RAC) and alveolar septal thickness. The distribution and expression of cyclinA2 and p21 were detected by immunohistochemistry and Western blot. Results The RAC value of the model group was lower than that of the control group from 3 days. The thickness of the alveolar septum was higher than that of the control group from 7 days (P <0.05). The expression of p21 protein in the model group began to increase from 3d, peaked on 14d, and lasted for 21d. The expression of cyclinA2 protein in model group was higher than that in control group at 14d and 21d (P <0.05). There was a negative correlation between RAC and p21 protein expression in model group (r=-0.5966, P <0.01), and no correlation with cyclinA2 (r= 0.7276, P >0.05); there was no correlation between RAC and p21 in the control group (r=-0.2929, P >0.05), and positively correlated with cyclinA2 (r=0.8476, P <0.01). The alveolar septal thickness of the model group and the control group were both positively correlated with P21 (r=0.4291, P <0.05; r=0.4447, P <0.05), and negatively correlated with cyclinA2 (r=-0.6814, P <0.01; r=-0.7636, P <0.01). Conclusion The imbalance of cell cycle regulatory protein cyclinA2 and its inhibitor p21 expression in neonatal rats exposed to hyperoxia may be one of the related factors that interfere with the development of BPD alveoli. 【Key words】 cyclinA2; p21; Alveolar dysfunction; Hyperoxia; Neonatal rats Fund program: National Natural Science Foundation of China (81501292); China Postdoctoral Fund Project (2017M611285) 支气管肺发育不良（BPD）是早产儿最常见的慢性呼吸系统疾病，临床上使用温和的机械通气策略后，其发病率仍没有改善[1,2]。BPD复杂的病理过程是由基因水平和环境因素的相互作用而导致[3]。与经典型BPD相比，新型BPD的主要病理改变以肺发育停滞及肺微血管发育不良为主要特征，表现为肺泡数目减少、肺泡结构简单化，肺微血管形态异常，肺泡间隔减少等导致的肺泡结构异常[4]。目前关于BPD肺泡发育障碍及其相关的分子作用机制仍不清楚，有待进一步研究。 肺的正常发育有赖于肺细胞增殖和抑制增殖相关基因在时间及空间上的有序表达来维持。在肺发育的各个阶段，一旦某些干扰因素出现如早产、高氧暴露等，则可能引起肺细胞增殖平衡紊乱，进而导致肺发育的异常[5]。cyclinA2作为细胞周期蛋白，在细胞增殖过程中发挥促进增殖的重要作用，p21则为具有最广泛激酶抑制活性的细胞周期蛋白，与细胞周期的抑制有关，参与细胞周期调控，分化、成熟[6]。研究表明，cyclinA2与p21表达失衡与多种肺疾病，如肺纤维化、特发性肺间质纤维化、慢性阻塞性肺疾病和哮喘等有关[7]。本研究通过制备高氧新生SD大鼠BPD模型，观察BPD发生过程中肺组织结构的变化以及从肺发育及肺泡化障碍角度探讨p21、cyclinA2在BPD模型中的作用，初步阐明p21、cyclinA2与肺发育及BPD发生的相关性，为BPD的机制研究以及有效防治提供理论基础。 1 材料和方法 1.1材料与试剂 本实验经中国医科大学附属盛伦理委员会批准（2016PS362K）。实验动物8周龄SD大鼠雌鼠36只，雄鼠各9只，重量200g-220g，SPF级，由沈阳华阜康有限公司提供。实验试剂p21抗体、cyclinA2抗体购自Abcam公司，SABC免疫组化试剂盒购自武汉中杉金桥有限公司，RIPA裂解液，超敏ECL发光液，上样缓冲液等购自碧云天试剂公司。 1.2方法 1.2.1实验动物分组及造模 将45只SD大鼠雌雄交配(4：1)合笼。每只SD孕鼠分别独立饲养，在孕22d时自然分娩。将自然分娩的新生SD大鼠(连同母鼠)于生后12h内随机分为2组，BPD模型组（FiO2＝80%-85%）和对照组（FiO2＝21%），每组40只，采用本研究组既往已建立的模型制备方法制备模型[8]。 1.2.2标本采集 于实验开始后1d、3d、7d、14 d、21d每组随机选取8只新生SD大鼠，分离双肺，左肺制备蜡块，用于HE染色、免疫组织化学染色，其余肺组织冻于-80℃冰箱用于蛋白检测。 1.2.3 肺发育程度评价 HE染色后分别用RAC和肺泡间隔厚度评估肺泡发育程度。从呼气性细支气管（没有完整内皮为特征）中心至最近胸膜（或纤维膈）引一垂直线，计数该直线上的肺泡数量即为RAC。100 倍光镜下，每张切片计数所有RAC，取平均值。 1.2.4免疫组织化学 石蜡切片经脱蜡水化后，热修复抗原，3%BSA室温封闭30min，加p21，cyclinA2抗体（1：200稀释），4 ℃过夜，同属性二抗室温孵育30min，DAB显色、苏木精复染细胞核后，脱水封片。 1.2.5 Western blot 肺组织裂解液匀浆后，取40μg总蛋白上样电泳，转PVDF膜，5%脱脂牛奶封闭2h，一抗4℃孵育过夜。二抗孵育2h，洗膜后ECL发光，显影分析。 1.3统计学方法 使用 SPSS 21.0软件进行统计分析。数据以均值±标准差表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析法(ANOVA)，相关性分析应用Spearman分析，P＜0.05为差异有统计学意义。 2 结果 2.1肺组织形态学改变 两组在1d的肺组织形态学没有明显差异，表现为肺泡结构不规则，肺泡间隔数量减少；对照组3d肺泡数量有所增加，间隔变薄，模型组3d肺泡间隔开始增厚；7d肺泡和肺泡隔数量明显增加，间隔继续变薄，肺泡大小一致，14、21d肺泡变得更加规则，肺泡和肺泡隔更加密集；模型组肺泡数量减少，肺泡次级间隔减少、中断、肺泡体积变大，肺泡结构简单化；14和21d时，肺泡腔明显增大，肺泡间隔明显增厚，肺泡数量减少，肺泡的正常结构消失(图1)。 图1 对照组和模型组肺组织的形态学改变 2.2 肺发育评价 与对照组相比，模型RAC值3d开始降低,7d、14d及21d差异有统计学意义 (7.5±1.15比5.5±1.17；8.8±1.22比5.0±1.25；9.5±1.23比4.6±1.20；P＜0.01)（图2a）。模型组1d 、3d的肺泡间隔厚度无明显统计学差异 (5.4±0.51比5.3±0.48；5.38±0.85比5.33±0.83；P＞0.05)，肺泡间隔厚度从7d开始升高(5.2±1.15比8.4±0.55；P＜0.01)，21d 达最高(3.5±1.10比13.5±1.07；P＜0.01)（图2b）。 图2（a）模型组与对照组肺组织RAC值比较，*P＜0.01；（b）模型组与对照组肺组织肺泡间隔厚度比较, *P＜0.01 2.3 p21、cyclinA2蛋白的定位及表达 肺组织中p21、cyclinA2蛋白主要表达于支气管上皮细胞和肺泡上皮细胞的细胞核(图3a，图4a)。免疫组织化学结果显示对照组p21蛋白在各组之间呈持续低水平表达，模型组p21蛋白于3d开始逐渐升高，随着氧暴露时间的延长呈棕黄色颗粒的p21蛋白呈持续高水平表达，14d表达最高，21d仍持续高表达；Western blot结果进一步表明7d、14d及21d模型组p21蛋白的表达明显高于对照组(0.25±0.204比1.34±0.367；0.25±0.191比1.68±0.340；0.30±0.250比1.75±0.358；P＜0.01)（图3b,c）。免疫组化结果显示对照组cyclinA2蛋白从3d开始升高，7d表达最高，随后逐渐下降，模型组cyclinA2蛋白同时于7d表达最高，随后明显下降，14d表达最低；Western blot结果显示14d及21d模型组cyclinA2蛋白表达高于对照组(0.50±0.210比0.80±0.200；0.52±0.111比0.81±0.246；P＜0.05) （图4b,c）。 图3 （a）免疫组化检测不同时间点两组肺组织中p21的表达；（b）western blot 检测不同时间点两组肺组织中p21的表达；（c）两组肺组织中p21的表达，两组比较*P＜0.01 图4 （a）免疫组化检测不同时间点两组肺组织中cyclinA2的表达；（b）western blot 检测不同时间点两组肺组织中cyclinA2的表达；（c）两组肺组织中cyclinA2的表达, *两组比较P＜0.05 2.4 p21，cyclinA2蛋白表达与肺发育指标的相关性分析 选取7d,14d，21d三个时间点，模型组p21蛋白和cyclinA2蛋白,肺泡壁厚度和RAC值进行相关性分析，Spearman相关性分析表明，模型组中p21蛋白表达与RAC值呈负相关 (r=-0.5966，P＜0.01)，与肺泡壁厚度值呈正相关 (r=0.4291，P＜0.05 )；cyclinA2蛋白表达与肺泡壁厚度值呈负相关（r=-0.6814，P＜0.01），与RAC值无相关性（r=0.7276，P＞0.05）；选取3d,7d两个时间点，对照组p21蛋白和cyclinA2蛋白,肺泡壁厚度和RAC值进行相关性分析，对照组肺组织中p21随着天数的增加，表达无明显差异，与RAC值无相关性（r=-0.2929，P>0.05），与肺泡壁厚度值呈正相关（r=0.4447，P＜0.05），cyclinA2蛋白的表达于3d开始升高，7d达最高，RAC值也逐渐增加，Spearman相关性分析表明，cyclinA2蛋白表达与RAC值呈正相关(r=0.8476，P＜0.01)，与肺泡壁厚度值呈负相关（r=-0.7636，P＜0.01）。 3 讨论 BPD是一种常见的早产儿呼吸系统疾病，最新的研究显示胎龄小于32周，出生体重小于1000g的新生儿BPD的发生率高达77%[9]。BPD远期会诱导多种呼吸道并发症，影响患儿青少年期的肺储备功能及神经系统功能。高氧模型是BPD的经典模型之一，本研究使用此模型来探索BPD肺泡化障碍的发病机制。我们观察到随着氧暴露时间延长，新生大鼠逐渐出现肺泡壁增厚，肺泡数目减少，结构简单化，肺泡次级分隔形成中断， RAC值持续降低、肺泡间隔厚度明显增加等表现，以上表明肺泡发育停滞，符合新BPD肺发育障碍特点，提示BPD 动物模型制备成功。 在胚胎发育和损伤后修复过程，细胞增殖和凋亡调控肺组织结构的重建[10]，当用氧气和机械通气治疗早产儿慢性肺疾病时，肺上皮和基质细胞就会发生增殖紊乱[11]，广泛细胞外基质的重塑，伴随着小肺动脉及气管平滑肌细胞的大量增殖[12]。细胞增殖依赖于细胞周期的活动，而细胞周期的完成有赖于正负调控蛋白之间的平衡。细胞周期的调控因子包括正调控细胞周期蛋白和负性调控周期蛋白依赖性蛋白激酶抑制物[13]。cyclins和p21作为调控细胞周期G1到S期转换的蛋白，在细胞增殖过程中分别起促增殖与抑制增殖的相反作用[14, 15]。cyclinA2表达于机体的多种细胞的胞核；cyclinA2有两种作用，一方面与CDK2形成cyclinA2/CDK2复合物，在DNA合成阶段控制G1/S期的转换，另一种是形成cyclinA2/CDK1复合物控制G2/M期进入有丝分裂[16]。本研究证实模型组cyclinA2的表达逐渐减低，我们推测cyclinA2蛋白可能促进肺泡的发育。p21作为细胞周期的负调控蛋白，参与许多生理过程，如细胞周期调控、DNA合成及修复、细胞分化、成熟等[17]。高表达的p21构成G1期检查站，阻止细胞从G1期向S期的转化，为细胞进行DNA修复赢得时间[18，19]。Resseguie EA等[20]发现高氧可导致肺泡上皮细胞线粒体功能异常，p21表达增高及核DNA断裂，进一步验证了我们的结论,异常表达的p21可能与高氧后肺泡发育障碍有关。 本研究从组织学水平证实高氧刺激下模型组p21较对照组表达水平明显升高，这与Braun RK 等[21]的研究结果一致；随着氧暴露时间延长cyclinA2水平先升高后降低，促进细胞增殖的作用逐渐减弱，此时p21抑制增殖的作用强于cyclinA2促增殖的作用，p21发挥主要作用，且最终表现为肺泡上皮细胞增殖受抑制，虽然在14d、21d cyclinA2在两组表达均降低，但模型组稍高于对照组，且组化结果显示其主要定位于间质细胞；所以我们猜测此阶段增高的cyclinA2可能并未参与肺泡发育的过程，而是机体的部分代偿作用，可能参与促进肺间质细胞增殖，致肺泡间隔增厚，也有可能高表达的cyclinA2参与了上皮间质转分化过程。Auten RL等研究发现p21可抑制肺细胞增殖，在新生儿慢性肺疾病紊乱的细胞增殖和肺泡增生中发挥重要作用[22]，这与我们的研究结果相一致；Londhe VA等[23]发现高氧通过降低组蛋白脱乙酰化酶HDAC1活性上调p21来调控肺细胞的增殖及凋亡，参与BPD模型肺泡化障碍，进一步吻合我们的结论，异常表达的p21抑制肺发育相一致。本实验又从肺发育的角度证明p21与该模型肺发育呈负相关，cyclinA2与肺发育呈正相关。在对照组中，随着肺发育与进一步肺成熟，cyclinA2于7d表达最高，且与肺发育成熟度指标RAC值呈正相关，与肺泡间隔厚度呈负相关，促进肺泡发育及分化成熟，而模型组p21蛋白14d表达最高，与RAC值呈负相关，与肺泡间隔厚度呈正相关，从而抑制细胞增殖，以及肺泡发育、肺泡间隔的形成，过高表达的p21抑制肺成熟。 综上所述，本研究初步揭示了p21和cyclinA2蛋白在BPD中的表达特点，以及与BPD和肺发育成熟度的相关性。p21蛋白在肺泡发育障碍的起到一定作用；而cyclinA2蛋白可能参与调节肺泡发育，并对肺泡发育起到保护作用。暴露高氧新生鼠肺组织细胞周期调控蛋白cyclinA2及其抑制因子p21表达失衡，可能是干扰BPD肺泡发育的因素之一，对其的研究可能为后续明确BPD的机制以及BPD的临床治疗奠定了基础。 参考文献 [1] 茹喜芳,王颖,谢生勇,冯琪,张欣,李星,桑田,宋秀婷.早产儿支气管肺发育不良发病及随访情况分析[J].中华实用儿科临床杂志,2017,32(2):100-104.DOI: 10.3760/cma.j.issn.2095-428X.2017.02.006. 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