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神外前沿讯，近期，中国人民解放军总医院第一医学中心神经外科余新光教授（访谈链接）、陈凌教授（访谈链接）团队的研究文章《Glioblastoma extracellular vesicles induce the tumour-promoting transformation of neural stem cells》（胶质母细胞瘤来源的细胞外囊泡诱导神经干细胞发生促肿瘤转化），在线发表于知名期刊《Cancer letters》。
复发胶质母细胞瘤的治疗是脑肿瘤治疗领域一直悬而未决的难题。长期以来，经综合治疗的胶质母细胞瘤患者的5年生存率为5.6%[1]，中位生存期14-16个月。肿瘤复发成为众多胶质母细胞瘤患者挥之不去的梦魇，因此，开展胶质母细胞瘤复发的机制研究具有重要意义。 解放军总医院神经外科团队在多年临床工作的基础上，总结了大量复发胶质母细胞瘤患者病例资料，发现相当一部分复发往往好发于脑室旁，且常沿脑室壁蔓延生长，影像基因组学研究也证实了这一特点[2]。 那么，脑室壁部位有什么特殊之处呢？答案可能就在于室管膜下区。研究证实成体哺乳动物大脑室管膜下区含有大量的处于静息与“休眠”状态的神经干细胞[3]，研究团队推测室管膜下区的神经干细胞很可能参与了胶质母细胞瘤的形成或发展。 自2017年以来，研究团队展开了相关实验研究，涵盖了细胞外囊泡制备分析和单细胞测序等前沿技术，在实验研究结果证据的基础上，解放军总医院神经外科团队独立提出胶质母细胞瘤来源的细胞外囊泡可能诱导神经干细胞发生恶性转化并促进胶质母细胞瘤复发的胶质母细胞瘤复发新理论。 
图1胶质母细胞瘤来源的细胞外囊泡诱导神经干细胞发生分化 （A）培养体系中加入胶质母细胞瘤来源EVs或培养液（CM）的神经干细胞发生分化（A-F），对照组无变化（G-R）。（B）所使用的神经干细胞在加入EVs前表达干细胞标记。（C） 经EVs诱导分化后的神经干细胞的CD133表达转为阴性。（D）经EVs诱导分化后的神经干细胞的分化标记GFAP和NeuN表达转为阳性。
研究结果表明：来源于胶质母细胞瘤的细胞外囊泡能够在体外诱导神经干细胞球发生恶性转化。转化后的神经干细胞球发生分化生长，且其增殖速度、Ki67表达率、迁移能力与胶质母细胞瘤细胞系无显著性差异；转化后的神经干细胞具有明显的侵袭能力，能够在软琼脂中形成单克隆并长期存活，且单克隆中细胞具有向周围琼脂的侵袭能力。 
图2 经EVs诱导分化后神经干细胞的增殖能力检测 （A）经EVs诱导分化后的神经干细胞与胶质母细胞瘤细胞系增殖速度基本一致。（B）经EVs诱导分化前、后的神经干细胞与胶质母细胞瘤细胞系的Ki67表达对比。（C）经EVs诱导分化后的神经干细胞与胶质母细胞瘤细胞系的Ki67表达率无显著差异。（D）经EVs诱导分化后的神经干细胞能够在软琼脂中形成单细胞克隆，正常神经干细胞不能形成。（E）经EVs诱导分化前、后的神经干细胞与胶质母细胞瘤细胞系的克隆形成率对比。
研究还发现：转化后的神经干细胞能够在体内实验中促进胶质母细胞瘤肿瘤形成。体内实验中，裸鼠皮下分别移植了单独的胶质母细胞瘤细胞系以及胶质母细胞瘤细胞系和转化后神经干细胞的混合细胞（细胞比例为4:1），两组移植的细胞总量一致，实验结果表明，混合细胞移植组的肿瘤体积显著大于胶质母细胞瘤细胞系单独移植组。免疫组化证实，混合细胞移植组形成的肿瘤其高倍镜视野下平均有丝分裂象数目、Ki67阳性率、Sox2阳性细胞数均显著高于单独移植组。 
图3经EVs诱导分化后的神经干细胞促进胶质母细胞瘤形成 （A）混合细胞移植组与单独移植组所形成肿瘤对比。（B）混合细胞移植组与单独移植组所形成肿瘤体积大小具有显著性差异。（C）混合细胞移植组与单独移植组所形成肿瘤的HE染色和免疫组化结果。（D）混合细胞移植组与单独移植组所形成肿瘤在GFAP、Vimentin、S100和Nestin表达上无显著差异。（E）混合细胞移植组与单独移植组所形成肿瘤在高倍镜视野下平均有丝分裂象数目具有显著差异。
课题组进一步的单细胞测序及数据分析研究表明：在神经干细胞的恶性转化过程中，细胞群体的基因转录组发生了显著改变，且转化后的细胞群存在显著的异质性。根据不同细胞群的基因表达差异，转化后的细胞可以被分为9个细胞亚群，不同的细胞亚群具有各自的生物学功能。将胶质瘤相关基因在9个细胞亚群中进行检索及标志基因分析，发现第8亚群细胞表达较多胶质瘤相关基因，可能在肿瘤复发中发挥重要作用。通过对第8亚群细胞进行WGCNA分析，发现CXCL14、EFEMP1、SCRG1和S100B基因位于基因共表达网络中心位置，进一步的分析表明，与在神经干细胞中表达相比，这四种基因在第8亚群中出现了特异性表达升高。此外KEGG分析表明，PPAR信号通路可能也参与了神经干细胞的转化过程。混合了神经干细胞和转化后细胞的单细胞测序数据t-SNE分析表明，在细胞群中存在一个单独由62个转化后细胞组成的亚群，此细胞亚群代表了转化后细胞的特点，对其标志基因进行分析再次发现了CXCL14、EFEMP1基因。 
图4经胶质母细胞瘤来源EVs诱导分化后神经干细胞进行转录组单细胞测序数据分析 （A）送检细胞群可分为9个不同细胞亚群。（B）展示不同细胞亚群含有细胞数目。（C）9个细胞亚群进行差异基因表达分析和功能分析。（D）不同细胞亚群代表性标志基因的表达地图展示。
图5经胶质母细胞瘤来源EVs诱导分化后神经干细胞进行转录组单细胞测序数据分析 （A）第8细胞亚群中WGCNA分析。（B）经胶质母细胞瘤来源EVs诱导分化后神经干细胞的重要基因Violin plot分析。（C）未诱导的神经干细胞的重要基因Violin plot分析。（D）经胶质母细胞瘤来源EVs诱导分化后神经干细胞的KEGG分析。（E）未诱导的神经干细胞的KEGG分析。
以上研究及证据表明，胶质母细胞瘤来源的细胞外囊泡能够诱导神经干细胞发生恶性转化，之后进一步促进肿瘤的形成，并显著增加肿瘤的侵袭能力。这与临床上观察到的复发肿瘤生长速度加快现象相符合。在上述恶性转化过程中，CXCL14、EFEMP1、SCRG1、S100B基因和PPAR信号通路可能发挥了重要作用。 2018年底，发表于Nature杂志的一篇报道表明，转基因小鼠室管膜下区的神经干细胞发生的突变能够导致高级别胶质瘤的形成[4]，这一结果，与解放军总医院的研究似有异曲同工之处，只是作者是从胶质瘤发生的病因学角度探讨了神经干细胞恶性转化的可能机制。 解放军总医院团队的此项研究，初步阐明了胶质母细胞瘤复发的一种新的可能机制，即残余胶质母细胞瘤释放的细胞外囊泡诱导室管膜下区的神经干细胞发生恶性转化，转化后的神经干细胞进一步促进胶质母细胞瘤的复发与侵袭。 这也给延缓胶质母细胞瘤复发的治疗提供了新的思路：一、对初发的胶质母细胞瘤术后患者进行放射治疗时靶区可适当覆盖肿瘤病灶附近范围内的室管膜下区，杀灭此处可能存在的残余肿瘤细胞及日后可能被“策反”的成体神经干细胞，延缓复发。二、针对细胞外囊泡设计开发相关药物，阻断细胞外囊泡信号传递或基因及信号通路的活化。 附：文章原文官方链接 https:///10.1016/j.canlet.2019.09.004 请扫描上面二维码访问
主要参考文献： [1] Ostrom Q.T.,Gittleman H, Truitt G, et al. CBTRUS statistical report: primary brain and other central nervous system tumors diagonised in the United States in 2011-2015. Neuro-Oncology, 20 (2018) iv1-iv86.[2] B.M. Ellingson, A. Lai, R.J. Harris, et al. Probabilistic radiographic atlas of glioblastoma phenotypes. AJNR Am J Neuroradiol, 34 (2013) 533-540.[3] F. Doetsch, I. Caille, D.A. Lim, et al.Subventricular zone astrocytes are neural stem cells in the adult mammalian brain. Cell, 97 (1999) 703-716.[4] J.H. Lee, J.E. Lee, J.Y. Kahng, et al. Human glioblastoma arises from subventricular zone cells with low-level driver mutations. Nature, 560 (2018) 243-247.
余新光，现任解放军总医院神经外科主任，主任医师、教授。军队技术三级，文职一级。全军神经外科专业委员会主任委员、中国医师协会神经外科医师分会副会长、中国研究型医院学会脑功能研究与转化专业委员会主任委员，中国人工智能学会脑科学与人工智能专业委员会副主任委员、中华医学会神经外科学分会委员兼脊柱脊髓外科学组组长。专业涉及颅底和脑深部肿瘤、颅颈交界畸形和脑机接口等领域。在国内首先提出“中央颅底”的概念。指导团队在国内完成首例DBS技术治疗痴呆，在人体成功实现脑机接口'意念'打字。 现主持科技部重大科研项目“重大出生缺陷三级防治示范应用”、多项国家自然科学基金。以第一完成人获得军队科技进步一等奖和军队医疗成果二等奖。与清华大学合作荣获国家科技进步一等奖。 
陈凌，医学博士，现任中国人民解放军总医院神经外科主任医师，教授，博士生导师。曾任亚洲神经外科医师协会（ACNS）副主席、世界神经外科联合会（WFNS）神经外科技术委员会委员。中国医师协会脑胶质瘤专业委员会第一届药物与生物专业委员会副主任委员、中国研究型医院学会脑功能研究与转化专业委员会常务委员兼副秘书长、中国抗癌协会神经肿瘤专业委员会常务委员。北京市科技新星，北京市高层次卫生技术人才，北京市“十百千”卫生人才，教育部“新世纪优秀人才”。从事临床神经外科工作24年，临床上积极开展多种前沿新技术，承担国家级、省部级临床及应用基础研究项目30余项。担任国家“十二五”科技支撑计划项目“基于分子病理学的脑胶质瘤个性化及综合治疗研究”首席专家、课题负责人。在国际国内期刊上发表文章90余篇。获国家科技进步二等奖1项，教育部高等学校科学技术进步奖一等奖、二等奖各1项，中华医学科技奖--医学科学技术奖三等奖1项。在颅脑肿瘤的诊治领域，与国际先进水平保持同步。
王健 解放军总医院第一医学中心神经外科学博士，主治医师，中国抗癌协会脑胶质瘤专业委员会委员，长期从事脑肿瘤的基础与临床研究。
孙国臣 副主任医师，神经外科学博士。致力于脑肿瘤的手术治疗，尤其是脑胶质瘤的微创精准外科手术。对颅内病变的影像诊断及鉴别诊断具有较丰富的经验。第一作者发表SCI论著6篇。参编精准神经外科著作一部。在颅内胶质瘤外科治疗方面，以第一申请人获7项课题资助。获军队医疗成果二等奖1项，解放军总医院科技成果一等奖1项，中华医学科技三等奖1项。现为中国医疗保健国际交流促进会颅脑损伤学分会委员，中国研究型医院学会神经外科分会青年委员，北京抗癌协会神经肿瘤专业委员会委员，北京医学会神经外科分会青年委员。享受军队优秀专业技术人才岗位津贴。
刘嘉霖 主治医师，医学博士，中国抗癌协会脑胶质瘤专业委员会委员。2009年毕业于南方医科大学，2009-2015年解放军医学院攻读神经外科临床硕士及博士学位，2015年1月-7月美国哈佛医学院-分子基因生物研究室从事博士后研究。回国至今在解放军总医院神经外科工作。发表SCI论著10篇,获中国发明专利一项，获军队医疗成果二等奖1项，中国医药教育协会科技进步三等奖1项，解放军总医院科技进步奖三等奖1项。参编混合现实医学著作一部，参编《中国中枢神经系统胶质瘤免疫和靶向治疗专家共识》。承担解放军总医院苗圃基金1项，吴阶平基金1项，国防科技项目基金1项。
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