老司机教你玩转神经元Sholl Analysis-Image J

Sholl Analysis是分析神经元复杂性的经典方法，下图是Nature Communications使用商业化软件Neurolucida software进行Sholl Analysis 的图片：

一、什么是Sholl Analysis？

Sholl Analysis 以神经元胞体为圆心（不包括胞体）开始画一系列同心圆（如b图右上角示意图所示），得到随离胞体距离变化的神经元突起交点（Intersections/Crossings）个数，以此来反映神经元的复杂性。上图结果显示从离胞体大概80-200μm处LHF: light off组神经元复杂性高于比Ctrl:  light off与LHF: light on组。除分析高尔基染色外，Sholl Analysis还可以分析免疫荧光标记的神经元、小胶质细胞的复杂性。

 

问题来了，如果没有商业化软件是不是就不能完成Sholl Analysis？

当然不是。美国NIH开发了一款功能强大且适用于多种电脑操作系统的免费软件——ImageJ，该软件也可进行Sholl Analysis。今天老司机就手把手给大家分享使用ImageJ进行Sholl Analysis！

 

二、ImageJ软件、Sholl Analysis插件下载与安装

ImageJ/Fiji是预捆绑了许多常用插件的ImageJ，下载链接：http:///Fiji/Downloads。

Sholl Analysis插件下载链接：http:///Sholl。

Fiji软件已安装Sholl Analysis插件，Analyze -> Sholl处可见：

其他版本ImageJ则需将下载Sholl Analysis插件放置Plugins文件夹下，重启ImageJ软件Analyze -> Sholl处可见Sholl Analysis：

三、Sholl Analysis详细步骤

1、ImageJ软件打开神经元图片，Image -> type -> 8-bit将图片转换为8-bit灰度图片。如图片为多通道荧光图片则需先通过Image -> Color -> Split Channel拆分为灰度图片。

Process -> Binary -> Make Binary，使神经元变化二值化图片：

2、使用ImageJ直线工具以神经元胞体中心为起点向最长突起处画直线：

 

3、Analyze -> Sholl -> Deprecated -> Sholl Analysis，进入Sholl Analysis参数界面：

Definition of Shells可设置开始Sholl分析的半径（即胞体的大小），Ending radius为最长突起的位置即Sholl分析结束的半径，Radius step size设置两个分析半径之间的步进：

Output Options可以设置导出结果，包括Intersections mask与显示在分析图像上显示交点与同心圆：

Intersections mask为伪彩图片，颜色深浅代表交点数（也有文献称为Branches，等同有分支才会有交点）。点击Analyze -> Tools -> Calibration Bar可以添加bar，设置bar位置（Location）、颜色、字体大小等，点击OK即可，可见最多交点为43个：

4、Sholl Analysis结果解读

除得到Intersections mask与显示在分析图像上显示交点与同心圆外还可以得到多种数据。

交点数目的Semi-log plot，交点数目被归一化到每个交点数目对应Sholl分析面积。两条回归线表明，回归线即可以拟合到所有数据点（蓝色直线），也可以拟合在10-90百分位的子集（红色直线）。R²为决定系数，L是Sholl回归系数。List可查看并保存数据。

Sholl Analysis还可以得到Sholl Profiles，包括不同半径对应的交点数、交点数的多项式拟合、交点数/面积等绘图数据：

Sholl Analysis最重要的数据是得到随离胞体距离变化的神经元突起交点（Intersections/Crossings）个数：

上图每个小十字架为对应分析半径的实际交点数目，蓝色曲线为对2D distance与交点数目进行多项式拟合的曲线。R2为拟合曲线与散点的相关性为0.984，右上角还有一些数据可由下图进行逐一解释：

Max：实际交点数最大的位置。

N_m：临界值，即拟合曲线最高点对应的交点数，对应的Sholl半径为临界半径r_c。

N_av：指所有交点的平均值。

曲线中心的x为分析形状的质心所在位置。

RI_max：实际交点数最大值与Starting radius交点数目/分枝数的比值。RI_Nm为交点临界值交点数与Starting radius交点数目/分枝数的比值。

点击List可查看并保存Sholl profile （Liner） for 神经元数据：

5、导出数据Graphpad Prism重新绘图

导入保存数据：

选择绘制折线图：

得到两根折线图：

 

双击折线，进入Format Graph界面。Data set选择Data 1: Data Set-A，勾选Show symbols，Shape设置为十字，Size为2，Border color为Gray：

同时勾选掉Show connectingline/curve，即不显示连接线，点击OK：

 

得到与ImageJ软件类似的图片：

每组Sholl分析多张神经元后即可得到文献中类似的Sholl分析结果图：

今天给大家分享使用ImageJ进行Sholl Analysis就到此为止了，希望对大家有所帮助！

 

参考文献：

1. Yang Y, Wang ZH, Jin S, et al.Opposite monosynaptic scaling of BLP-vCA1 inputs governs hopefulness- andhelplessness-modulated spatial learning and memory. NatCommun. 2016
2. Binley KE, Ng WS, Tribble JR, SongB, Morgan JE. Sholl analysis: a quantitative comparison of semi-automatedmethods. J Neurosci Methods. 2014