Golgi Staining操作和数据分析

桔梗下的小金鱼 2022-02-13

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入门指南

Golgi-Cox浸染法是研究神经元和胶质细胞正常和非正常形态最有效的方法之一。使用Golgi技术，在药物处理过的动物脑中和因神经疾病死亡的病人脑中发现了神经树突和树突微小的形态改变。

Part A 高尔基染色

原理：用重铬酸钾和铬酸钾，氯化汞作为初步固定剂浸润组织，铬盐和神经细胞中的蛋白质结合，氯化汞通过白色沉淀来标记单个细胞，进一步经过碱处理，使沉淀物变黑（硫化汞）。该法最显著的特点是其反应终产物都局限于单个神经细胞的内部，而其周围去多类似的神经细胞不着色，从外观上看，就好像从固定到脱水的全过程在细胞膜水平都存在一个阻止可见产物扩散的屏障。

The beauty of the method lies in one of its shortcomings: the Golgi protocol stains only a few hundred neurons out of the millions present. Thus, it is possible to visualize neurons and trace their path and connections in the brain against a pale yellow background with unsurpassed clarity. Without this ability to stain the few select neurons, everything would have looked like a large black blob on the brain section.。

1.明胶玻片的制备

高尔基染色的脑片较厚，如果使用普通玻片贴片，在染色过程中，脑片很容易从玻片上脱落下来，影响实验结果，对此需制备特殊明胶包被载玻片，以供高尔基染色使用。

方法：加热500 mL双蒸水，后加入10g明胶，搅拌溶解。待溶解后加入0.5g硫酸铬钾，搅拌溶解（此步骤需在通风橱内进行），定容至1L，过滤冷却至室温。将干净的玻片浸入溶液当中，避免气泡形成。37 °C烤干玻片。烤干后4℃保存。

2.脑组织标本收集

2.1在取脑前24小时提前等量混合A,B液，并不能搅拌。制备好的浸泡液在用之前室

温黑暗保存可长达一个月。每cm3待研究组织至少用5ml浸泡液。注意用较少的浸

泡液可能降低染色的灵敏性和可靠性。

2.2杀死动物之前对实验动物进行深度麻醉。应尽快地从颅骨中取出动物的脑（或死去

病人的脑），但操作时必须非常小心以免损伤或压迫组织。

2.3用双蒸水快速冲掉组织表面的血液。

2.4把组织浸泡在由溶液A和B等体积混合的浸渍液中，室温下黑暗保存两周*。浸泡

6个小时以后或次日更换新的浸渍液。

2.5转移组织到溶液C中室温黑暗至少72小时（可长达1周）。24小时后或次日至少

更换一次溶液。

3.冰冻切片

3.1 从C溶液中去除组织，擦除表面液体，置于-24℃切片机中的样本盘上滴加双蒸水

包被冰冻。

3.2 使用修块（Trim）模式进行切片，切片厚度100-150 um，按实际需要调整切片温度。

3.3 在写好标记的载玻片上滴一滴C液，可用毛笔涂开。用玻璃分针把样本转移到玻片

上，使之在C液中展开，注意脑片与载玻片中间不能留有气泡。载玻片上多余的溶液用吸管吸走并用滤纸吸干（载玻片上的溶液必须尽可能地吸干否则切片将从载玻片上脱落下来）。切片可以室温下自然风干（不能用电风扇或电热板使其干燥）。为取得最佳结果，应尽快地完成切片，制备好的切片如果保存于载玻片盒中，室温黑暗条件下

最长可保存3天。

4.高尔基染色

在染色过程中和盖盖玻片之前的任何一步都不要让切片变干

4.1 用双蒸水冲洗切片两次，每次4分钟。

4.2 碱化：把切片置于由1份溶液D，1份溶液E和2份的双蒸水组成的混合液中10分

钟。比如：溶液D 10ml 溶液E 10ml 双蒸水 20ml

注意工作液最好现配现用，每100ml工作液最多用于100张切片（比如小鼠脑），根据切片的大小。盛有工作液的瓶子或染色罐必须盖好盖子防止试剂蒸发。为取得最佳结果，孵育期间应频繁搅拌工作液。

4.3 用蒸馏水冲洗切片两次，每次4分钟（蒸馏水应频繁更换新的）。

4.4 在50%，75%和95%的乙醇中对切片进行脱水，每个浓度梯度脱水4分钟（不要跳过

任何一个步骤）。

4.5 然后在无水乙醇中对切片进行脱水，4次，每次4分钟（不要延长时间）。

4.6 在二甲苯中透明，3次，每次4分钟，并且用树脂封片剂对盖玻片进行封片。

4.7 避光晾干，拍照进行数据分析。

Part B 高尔基染色神经元数据分析

高尔基染色统计数据主要反映在树突复杂性(dendritic complexity)。统计数据有树突分支数（number of dendritic branch）、树突长度（dendritic length）、树突棘密度（dendritic spine density）等。使用ImageJ及一些相关图像处理软件，可以初步统计以上数据。

ImageJ 是一个基于java 的公共的图像处理软件，它是由National Institutes of Health 开发的。ImageJ 能够显示，编辑，分析，处理，保存，打印8 位，16 位，32 位的图片，支持TIFF,PNG, GIF, JPEG, BMP, DICOM, FITS 等多种格式。ImageJ的很多功能都是通过插件来实现的。比如NeuroJ插件就是用来统计神经元树突长度的，Sholl Analysis插件用来统计神经元分支数。

本文中还用到了NeuronStudio和Photoshop等图像处理软件。

1.树突长度和分支数分析

1.1拍照

在目标区域选取的神经元，结构应清晰可见，与其他神经元交集较少，便于分析。

由于受切片厚度影响，尽量选取完整的神经元。选好目标神经元后在X200物镜下

拍照。为了尽量使用2D照片还原立体的神经元，故应不断调整焦距拍照，尽量将

单个神经元全貌的各个细节拍下，便于分析。可每旋微焦5°拍下一张照片，依次

可拍下该个神经元的一批照片。注意保存标尺，方便后续分析。

2．I mageJ图片初步处理

2.1.1 打开文件，File→Import→Image Sequence，点击目标文件夹中的一张照片从而选中全套照片，在Sequence Option对话框中点击OK。即可得到目标神经元的合成照片，滚动鼠标轮轴可查看目标神经元各个层次的形态。

2.1.2 灰度转换，Image→Type→8-bit

2.1.3 保存图片，File→Save as→ConX200@06（*Tiff）

2.2 NeuronStudio软件 2D图片清晰化

由于合成的图片较“厚”，遮住了目标神经元的细节，所以需借助图像软件“过滤”，是目标神经元轮廓更为清晰，这里使用NeuronStudio软件进行图像处理。

2.2.1 打开NeuronStudio，File→Open→ConX200@06，导入之前合成的那张图片。

2.2.2 Run→Projections→Minimum

2.2.3 File→Save Projections

3．N euronJ测量分支数

3.1使用ImageJ打开之前处理好的图片

3.2 设置标尺，在图片标尺上画一直线，Analyze→Set Scale→Known Distance(例：50) →unit of length(例：um) →勾选Global→OK

3.3 打开NeuronJ补丁，Plugins→NeuronJ

3.4 点击打开图片。

3.5 点击，图上出现一十字光标，右击目标神经元胞体，开始追踪神经元，沿着树突方向移动鼠标，软件会相应追踪轨迹，如果轨迹偏离太远，可回到树突上，右击确定轨迹。追踪至该树突末端，双击结束该条树突的追踪。如有轨迹有误，需要删除，则点击，把鼠标放在该条轨迹上，该条轨迹会高亮，点击高亮的轨迹，会有对话框提示是否删除该轨迹，选择确认删除。用相同方法可追踪勾勒出整个神经元各级树突全貌（如下图）。