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一览丨呼吸道感染检测

 Cheximing 2019-10-12

呼吸道感染(RTI)分为上呼吸道感染(URTI)和下呼吸道感染(LRTI)。通常,下呼吸道感染(例如肺炎)比上呼吸道感染(例如普通感冒)要严重得多。本推送主要概述呼吸道感染的分类、主要感染源和呼吸道疾病的检测方法。之后会详细介绍目前公司的主要产品及技术原理。

呼吸道感染的分类

上呼吸道感染URTI

尽管上呼吸道和下呼吸道之间的确切界限存在一些分歧,但通常认为上呼吸道是声门或声带上方的气道。这包括鼻子,鼻窦,咽和喉。上呼吸道的典型感染包括扁桃体炎,咽炎,喉炎,鼻窦炎,中耳炎,某些类型的流感和普通感冒。URTI的症状可能包括咳嗽,喉咙痛,流鼻涕,鼻塞,头痛,低烧,面部压力和打喷嚏。大多数URTI是病毒性的,其次是细菌。URTI也可以源于真菌或蠕虫,但很少见。

下呼吸道感染LRTI

下呼吸道由气管、支气管和肺组成。下呼吸道感染通常比上呼吸道感染更严重。LRTI是所有传染病中的主要死亡原因。两种最常见的LRTI是支气管炎和肺炎。流感影响上呼吸道和下呼吸道,但更危险的菌株(例如高度有害的H5N1)倾向于与肺深处的受体结合。下呼吸道感染可以由细菌、病毒、寄生虫、支原体、衣原体及外来吸入性物质引起。

常见的感染源列表如下:

呼吸道感染的检测

呼吸道感染是人类致病和死亡的最主要原因之一。引起呼吸道感染的病原体种类很多,包括细菌、病毒、支原体和衣原体等,尤以病毒多见。无论病因如何,呼吸道感染的临床症状和体征都很相似,而不同种类病原体引起的感染,其治疗方法截然不同疗效和病程也不尽相同。因此,快速、准确地检测和鉴别病原微生物有助于临床进行诊断和治疗,并可用于流行病学的调查及预防性干预措施的制定。

和之前介绍感染检测类似,目前呼吸道感染的临床检测有显微镜检测、微生物培养、免疫学检测、核酸检测和各种质谱、色谱等。随着分子生物学技术的迅猛发展,微流控芯片、基因芯片、下一代测序等新兴技术已越来越广泛地应用于呼吸道感染的快速、灵敏、特异和高通量检测, 以满足患者和临床医生的需求以及促进新型感染源的发现。目前以PCR和NGS为基础的呼吸道感染检测正从传统的病原体确认,拓展到变异及耐药性检测,正逐渐改变呼吸道感染检测的传统格局。

分离培养

分离培养是呼吸道感染最经典的检测方法,亦是诊断的金标准。虽然组织分离培养为金标准,但是检测时间需要几天甚至几周,因此其结果很难用于临床治疗的指导。尽管如此,分离培养却是很多实验的前提条件,如抗生物敏感性实验(antibiotic susceptibility testing: AST),革兰氏染色(Gram staining)等。

尽管以PCR和NGS为基础的呼吸道感染检测十分火热,但这两种方法并不是万能的。PCR依赖于特定分子序列的扩增,无法解决未知序列及多种突变,且很难完全覆盖所有感染源。NGS数据量庞大,难以从中直接提取具有临床意义的信息,面对未知病原体时仍然难以给出确切信息。分离培养尽管速度慢,但结合其后续分析能够提供比较完整的临床检测结果,也符合目前的治疗体系。

目前这种方法仍然受到科研界的认可,很多科学工作者仍然在依靠传统的微生物培养进行感染检测。结合目前热门的微流控芯片技术,通过对单个细胞的行为研究微生物对抗生素的敏感性,实现传统的AST检测,速度仅仅需要半小

核酸扩增技术

现已应用于个体呼吸道检测的核酸扩增技术包括聚合酶链反应(polymerase chain reaction: PCR)、依赖核酸序列扩增技术(nucleic acid sequence based amplification: NASBA)、转录介导扩增技术(transcription mediated amplification: TMA)、链替代扩增反应技术(strand displacement amplification: SDA)、环介导的等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification: LAMP)、滚环扩增技术(rolling circle amplification: RCA)、解链酶扩增技术(helicase dependent amplification: HDA)、多重依赖探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification: MLPA)等。其中多重PCR、HDA、LAMP可以针对多个基因靶点同时检测2种以上的微生物。

由于多种病毒同时感染并不少见,且多重PCR成本低,能在收集样本后几小时内得到结果,是现在最具吸引力的检测方法,也是目前最常用的方法。FilmArray是将PCR的嵌套式和多重技术与DNA熔解曲线分析相结合的全自动一体化检测平台,结合微流控芯片技术,可以在一小时内完成样本准备、核酸提纯、PCR检测,整个过程都在密闭管中进行,基本上没有污染的风险。

芯片技术

芯片技术是研究基因组学、蛋白质组学的有力工具,同时也是目前的研究热点,近两年已有多篇重要期刊文章报道相关技术进展,这种技术在未来一定会有更好的应用前景。芯片技术与宏基因组学方法可提供快速病毒鉴定。在数据库中寻找可用的序列数据设计寡核苷酸探针,使芯片能在临床诊断中识别相应的病毒。这种方法可以有助于发现新的病毒,即使是没有基因恒定区的病毒也可通过测序获得检测结果。

下一代测序技术

从2005年开始,下一代测序在很短的时间内以其多样本、高通量、多功能的特点从根本上改变了基因组学领域,使之前由于技术缺陷而无法进行的试验都能得以开展。在过去的5年里,下一代测序一直应用于新病毒的发现,许多病毒和菌株用这种方法被鉴别出来。下一代测序具有令人难以置信的敏感性,它可以同时检测多个患者样本,确定特定病原体和病毒抗性,以确保患者得到适当的治疗。

有意思的是,今年6月在nature biotechnology上出现了利用纳米孔测序进行下呼吸道感染检测的文章。文章表明,纳米孔宏基因组学可以快速,准确地表征细菌LRI,敏感性和特异性经过数据分析可达到100%。利用这种技术可有助于减少广谱抗生素的使用,以避免耐药性的产生。

质谱分析技术

质谱MS可以提供丰富可靠的核酸、蛋白甚至完整的病毒序列信息,已成为病原体分子诊断的另一种选择。MS可以与各种色谱分析、亲和技术以及其他分子诊断技术结合应用,可大大提高其检出限。与纳米技术结合, MS可以检测痕量靶向病原体。病原体核酸PCR扩增也可与MS相结合作为替代方法。MS具有同时快速检测多种病毒,甚至是识别蛋白修改位点的优势。现在MS不仅仅用于蛋白质组学分析,在基因组学中的应用更是越来越普遍。现有的MS类型多种多样,用于病原体分析的MS类型有基质激光解吸离子化质谱(MALDI-MS)、表面增强激光解吸离子化质谱(SELDI-MS)、生物气溶胶(BAMS)、电喷雾质谱(ESI-MS)毛细管电泳质谱以及液相色谱质谱(LCMS)等。



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