CNV检测方法应如何选择？| aCGH | SNP-array | CNV-seq | MLPA |...

前言

CNV，即拷贝数变异（copy number variation），一般指长度为1kb到几个Mb基因组大片段的拷贝数复制、缺失。CNV在基因组中的存在形式主要有以下几种：两条同源染色体拷贝数同时出现缺失；1条同源染色体发生缺失，1条正常；一条同源染色体出现拷贝数重复，另一条正常；1条同源染色体出现缺失，另一条出现拷贝数重复；两条同源染色体同时出现拷贝数重复。

CNV在人类基因组中分布广泛，是人类疾病的重要致病因素之一。致病性CNV可引起智力障碍、生长发育迟缓、自闭症、各种各样的出生缺陷、白血病和肿瘤等多种疾病。目前对CNV进行检测的方法主要有aCGH, SNP-array, CNV-seq、MLPA等，这些方法各有哪些优缺点，我们又该如何选择？

检测方法一：aCGH

aCGH也称为基于芯片的比较基因组杂交（array-based comparative genomic hybridization）。

原理：将等量的待测DNA和正常对照DNA分别用红色和绿色荧光染料标记，混合，然后与全基因组DNA芯片进行竞争性杂交。杂交后的芯片经激光扫描，比较每个点红光和绿光的发光强度。若红光过强，表明待测样本拷贝数复制；若红光较弱，表明待测样本拷贝数缺失；若红绿光均等，则表明待测样品拷贝数正常。

应用：可以检测全基因组水平上的CNV。

点评：aCGH的分辨率，取决于芯片中探针在全基因组中的密度和探针长度。安捷伦SurePrint G3 Human CGH Microarray 1×1M芯片中，探针间距约为2kb。因为来自一个点的荧光的光强变化，可能会带有一定的偶然性，所以，一般是看染色体空间位置上相邻的3个点（或者更多的点），如果这3个点的荧光比值，都发生同一个方向的偏离，就可以判断这一段有拷贝数变异的证据。基于这点考虑，按照3个点计算，aCGH的分辨率约为6kb。

检测方法二：SNP-array

SNP（Single Nucleotide Polymorphisms，单核苷酸多态）是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性而形成的遗传标记。SNP在人类基因组中广泛存在，平均约每500-1000个碱基对中就有1个SNP，人类30亿碱基中大约有300万个。

原理： 与aCGH采用的双杂交策略不同的是，SNP-array利用待测样本与芯片探针进行单杂交，通过比较不同样本信号的强度来确定每个位点的拷贝数。

应用：SNP-array芯片的探针为SNP位点序列，可以提供SNP信息。除可检测CNV外，还可检测单亲二倍体(UPD)、杂合性缺失(LOH)和嵌合体。

点评：SNP 芯片探针在全基因组上的的密度非常大，分辨率很高。但是这些探针在基因组中并非均衡分布，在一些重复序列和复杂的CNV 区域， SNP 密度是较小的，不能得到较为清晰的CNV 图谱。Affymetrix 公司和Illumina 公司在新一代芯片中增加一个非多态性的探针，将探针更好地定位在特定区域，提高图谱的清晰度。目前Affymetrix 公司的CytoScan HD芯片为探针密度最高的芯片，含有270万个探针，基因间探针间距平均为1kb。按照3个点计算，SNP-array的分辨率约为3kb。

单倍体基因组中等位基因核内复制事件的检测

图中分别显示：四倍体、三倍体、二倍体、单倍体

检测方法三：CNV-seq

CNV-seq，即通过低倍全基因组测序检测CNV的技术，2009年由Xie[1]等开发提出。

原理：CNV-seq检测原理与aCGH相似。将等量的待测样本DNA和正常对照DNA建库测序后，分别与reference sequence进行对比。通过比较两个样本每个滑窗内比对reads数目的多少来确定每个位点的拷贝数。

应用：可以检测全基因组水平上的大片段CNV。

点评：贝瑞和康采用双盲实验设计，对染色体结构异常的样本进行检测，滑窗大小为20kb的情况下，CNV-seq和高密度SNP-array对于已知致病CNVs都能达到100%的检出[2]。与中等密度SNP-array相比，CNV-seq表现更优。鉴于CNV-seq价格较低，CNV-seq可以替代微阵列芯片用于大片段CNV检测。关于CNV-seq的分辨率取决于滑窗的大小。一般来讲，如果是低倍基因组测序，要使滑窗内的reads数目可信的话，所取的滑窗不可能太小。根据文章2描述，以20kb滑窗大小计算，按照3个点计算，CNV-seq的分辨率约为60kb。

aCGH和CNV-seq检测CNV过程比较

检测方法四：MLPA

MLPA(multiplex ligation-dependent probe amplication，多重连接依赖式探针扩增)于2002年由荷兰学者Dr.SchoutenJP等首先提出，是针对待检DNA靶序列进行定性和半定量分析的技术。

原理：在DNA靶序列的特定变异位点（如点突变）两侧设计一对MLPA探针。每条探针包含一段通用引物序列和一段特异性杂交序列。杂交序列与靶序列杂交后，使用连接酶将两部分探针连接成一条核苷酸单链，再使用通用引物进行PCR扩增。通过比较待测DNA与正常对照DNA的PCR产物量，来确定待测样本DNA靶序列的拷贝数。值得注意的是，连接酶很挑剔，只有在检测位点处探针与靶序列完美互补配对的情况下，连接酶才能将两部分探针顺利连接成单链进行后续扩增。如果检测位点存在甲基化、点突变、CNV，则探针连接失败，不能进行后续PCR扩增。

应用：验证高度怀疑的特定基因中的点突变、甲基化、CNV。

点评：该技术具有快速及特异性高的特点，但是不能对染色体组进行全局分析。单一反应管内可以同时检测40个不同的核苷酸序列的拷贝数变化。

 

总结

 

参考文献：

[1].Xie C, Tammi M. CNV-seq,a new method to detect copy number variation using high-throughput sequencing. BMC Bioinformatics, 2009, 10: 80

[2].Zhu X, Li J, Ru T, et al. Identification of copy number variations associated with congenital heart disease by chromosomal microarray analysis and next generation sequencing.[J]. Prenatal Diagnosis,2016, 36(4):321–327.