染色体病的分子诊断全解

程伟 

重庆医科大学附属第一医院临床分子医学检测中心

摘要:染色体数目或者结构的异常是导致染色体病的物质基础。随着人类基因组计划(HGP)的成功完成以及结构基因组学、功能基因组学等学科的发展,高通量测序、PCR技术、生命科学领域的基因芯片技术与生物信息学技术相结合,使染色体病的研究日益深入,染色体病的检测方法也日益增多。新的分子诊断技术以其高灵敏度、高准确性和高通量的特点在染色体疾病的检验和诊断中应用越来越广泛,目前已逐步与传统的细胞遗传学分析相互结合、互为印证,共同实现对染色体疾病的实验室诊断。该文就染色体病的分子诊断技术及临床应用进行述评。

1染色体病的分子基础

染色体数目或者结构的变化,可以使某个或多个基因增加或者缺失,从而导致基因表达改变,进而引起机体的形态、结构和功能发生变化,在临床上表现为一组特定的疾病症状群,称为染色体病。染色体异常的类型可以分为染色体数目异常及染色体结构异常^[1]。

1.1 染色体数目异常与疾病

染色体数目异常包括染色体组以倍数增加或减少的整倍性数目异常、单个或数个染色体增减的非整倍性数目异常及嵌合体3种类型。整倍性数目异常是指体细胞含有的染色体组倍数超过2倍(2n)。非整倍性数目异常是指正常的染色体组中,丢失或增加了一条或几条完整的染色体。常见的染色体数目异常疾病见表1。

表1常见染色体数目异常疾病

1.2染色体结构异常与疾病

由于物理、化学、生物、遗传和母亲年龄等因素的影响,体细胞中染色体结构会发生一定程度的异常改变,被称为染色体结构异常或染色体畸变。导致染色体结构异常的基础是染色体断裂和断裂后的异常重接。临床上常见的结构异常类型有缺失、重复、倒位、易位以及等臂染色体和环状染色体等。

 

图1染色体结构变异的常见类型

2染色体病的分子诊断策略

2.1荧光原位杂交(FISH)技术

FISH技术是世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上以荧光标记取代同位素标记而建立起的一种新的原位杂交方法,见图2。其基本原理是将核酸探针直接标记荧光或间接标记报告分子(生物素、地高辛等),依照碱基互补配对的原则与待测标本中的染色体或DNA纤维切片上的靶核酸序列进行杂交,使用荧光显微镜观察荧光信号,实现对待测标本中的靶核酸序列定位、定性及相对定量分析^[2]。

 

图2荧光原位杂交原理

FISH的检测过程主要包括玻片标本的制备、标本的预处理、探针和标本的变性、原位杂交、杂交后洗涤、复染和荧光显微镜观察信号及分析,一般在24 h内完成检测。FISH探针的类型有很多,在目前的染色体FISH分析中,直接、多色荧光标记的DNA探针逐渐成为临床检验工作者的首选,其可以在同一标本中同时检测出多种染色体异常。相较于传统染色体核型分析,FISH技术有快速、无需组织培养的优势。其可直接采用绒毛、羊水、脐带血的间期细胞,进行染色体非整倍体及结构异常的快速检测,见图3。研究证实将FISH技术应用于快速产前诊断,其准确性高、特异性强,对涉及13、18、21号染色体,以及X和Y染色体数目异常的检出率与“金标准”——染色体核型分析结果一致。临床上对血液肿瘤的FISH检测主要集中在对染色体易位形成的融合基因进行检测,如针对bcr/abl易位的DNA探针、针对t(15∶17)的DNA探针等,有助于血液肿瘤的诊断及预后判断。FISH技术还被广泛应用于乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌等实体肿瘤的辅助诊断,可检测石蜡切片标本中间期细胞的染色体易位、基因扩增或缺失等改变。

 

图3 FISH 用于13、18、21三体的产前诊断

2.2微阵列比较基因组杂交(Array-CGH)技术

Array-CGH技术将芯片技术和比较基因组杂交(CGH)技术相结合。无需染色体的培养,只需一次杂交即可实现对标本细胞整个基因组的全套染色体或DNA拷贝数量异常的全面检测,同时也可以对异常位点进行初步的染色体定位^[3],见图4。检测过程包括微阵列制备、待检DNA和对照DNA探针制备、杂交、数据处理和图像分析。微阵列分为DNA克隆微阵列和cDNA微阵列,采用专门的设备,按照在染色体中的分布或cDNA的基因确定靶点的排列顺序,将DNA克隆片段或cDNA逐个点样在特定材料的芯片上。寡核苷酸-CGH芯片是目前最新、分辨率最高的CGH芯片,无需点样,可直接在芯片上合成核酸靶序列。

近年来,许多产前诊断实验室利用Array-CGH技术对遗传性疾病所伴随的染色体异常进行了全面、系统的分析,获得了与G显带、FISH技术相一致的结果,且具有更好的分辨率和灵敏度,能够大规模、高通量地一次性检测所有染色体位点的异常,并能够自动分析结果,既简便又快速。除此之外,Array-CGH技术还在一些核型分析、FISH技术无法确诊的病例中识别出一系列新的染色体异常位点,提示Array-CGH技术在人类遗传性疾病的研究中起着越来越重要的作用。

图4  Array-CGH的检测原理

2.3多重连接依赖性探针扩增(MLPA)技术

ML-PA技术最早由荷兰学者SCHOUTEN等于2002年提出,近年来发展为一种可针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。MLPA的基本流程包括探针和靶序列DNA杂交,之后采用连接酶连接、PCR扩增,产物通过毛细管电泳分离及数据收集分析。每个MLPA探针包括两个荧光标记的寡核苷酸片段,一个由化学方法合成,一个由M13噬菌体衍生法制备,每个探针都包括一段引物序列和一段特异性序列。如果检测的靶序列出现点突变或发生缺失、扩增突变,那么相应探针的扩增峰便会缺失、降低或增加。因此,根据扩增峰的改变就可判断靶序列是否存在拷贝数的异常或点突变^[4]。

MLPA技术目前已经应用于多个领域、多种疾病的检测研究。针对常见的13、18、21号及X/Y染色体检测,首先寻找多个管家基因进行特异性探针设计,然后通过杂交、连接及PCR扩增,将获得的产物进行毛细管电泳分析,最后根据特定基因拷贝数的改变情况确定染色体的数目是否发生异常。MLPA的结果与传统核型分析方法相吻合,且大大缩短了诊断时间。同时,MLPA技术具有高通量、低成本、自动化及结果不受技术人员主观判读干扰等明显优于FISH技术的特点,可作为染色体非整倍体产前诊断的重要方法。对于亚端粒在内的染色体基因重排和染色体微缺失/微重复综合征,针对每一个染色体的亚端粒,MLPA技术都设有特异性探针,以实现经济、高效、快速检测亚端粒的基因重排和微缺失/微重复。

作者简介:程伟，博士，重庆医科大学附属第一医院临床分子医学检测中心 研究员，博士生导师。重庆市杰出青年基金获得者，重庆市学术技术带头人后备人选，重庆市中青年医学高端人才。“体外诊断新技术及转化”重庆市高校创新研究群体负责人。重庆市医学会精准医疗与分子诊断专委会副主任委员，重庆市中西医结合学会精准医疗与分子诊断专委会副主任委员，中国中西医结合学会检验分会肿瘤分子诊断专家委员会常委，中国生物工程学会细胞分析专业委员会委员。主要从事临床分子诊断技术新原理、新方法的研发及临床应用研究。发表第一作者及通讯作者SCI论文25篇，其中IF大于5论文23篇。先后主持国家自然科学基金项目3项，重庆市自然科学基金项目3项。2009年度中国分析测试协会科学技术奖一等奖，2013年教育部高校科学研究优秀成果奖自然科学一等奖，2017年获重庆市自然科学一等奖。参编全国高等医药院校医学检验技术专业规划教材《分子诊断学》（第四版）。

参考文献：

[1] TRASKB J.Human genetics and disease:human cytogenetics:46 chromosomes,46 years and counting[J].Nat Rev Genet,2002,3(10):769-778.

[2] CUIC,SHU W,LI P.Fluorescence in situ hybridization: cell-based genetic diagnostic and research applications [J].Front Cell Dev Biol,2016,4:89.

[3] CHEUNGS W,BI W.Novel applications of array com parative genomic hybridizationin moleculardiagnostics [J]. Expert Rev Mol Diagn, 2018,18(6):531-542.

[4]  SCHOUTEN J,VAN VUGHT P,GALJAARDR J. Prenatal Diagnosis[M].New York: Humana Press,2019:161-170.