蛋白免疫印迹法原理及细节

做实验也有一段时间了，对WB自己通过努力的学习并在老师的指导下也有了一定的认识，当然跟高手比差得远，把自己的经验和搜集的资料整理一下发出来，。

当室温温度低时，反应较慢，但是当温度高时，反应较快，实际上只加APS，只要时间足够，胶还是会凝的，当环境温度低时，这个过程相当长。

聚丙烯酰胺凝胶：由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。化学聚合法是以APs（过硫酸铵）和四甲基乙二胺（TEMED）为催化剂。APs自身会产生自由基，但效率较低，加入TEMED催化，促使APs产生更多的自由基，加速自由基与丙烯酰胺单体聚合，同时，丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。

十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：①去蛋白质电荷；②竭力蛋白质之间的氢键；③取消蛋白质分子内的疏水作用；④去多肽折叠。

过硫酸铵（APS）：固体较稳定，配制为10%的水溶液，室温不稳定，4℃保存1周，-20℃保存2个月。对皮肤粘膜有刺激性和腐蚀性。吸入后引起鼻炎、喉炎、气短和咳嗽等。眼及皮肤接触可引起强烈刺激、疼痛甚至灼伤。口服引起腹痛、恶心和呕吐。长期皮肤接触可引起变应性皮炎。

四甲基乙二胺（TEMED）：是一种无色透明的液体，有微腥臭味。TEMED可以催化APS产生自由基，从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合,可作为一种促凝剂使用 。4℃保存。遮光保存，一般用棕色瓶子储存，具有神经毒性。

制胶缓冲液：Tris-HCL缓冲液系统，浓缩胶缓冲液PH 6.7-6.8，分离胶缓冲液PH 8.8-8.9。

浓缩胶缓冲液PH 6.7-6.8，分离胶缓冲液PH 8.8-8.9：浓缩效应主要在浓缩胶中完成，浓缩胶的pH6.8，在这个pH条件下，缓冲液中的HCl的Cl离子几乎全部解离，Gly的等电点为6.0，仅少数解离为负离子，在电场中移动速度很慢。酸性蛋白质在此pH下解离为负离子，三类离子的迁移速率为Cl>一般蛋白质>Gly，电泳开始后，Cl离子泳动快，在其后留下一个低离子浓度区。Gly在电场中移动很慢，造成移动离子的缺乏，于是快慢离子间就形成了一个缺少离子的高压区，在高压区内所有的负离子都会加速移动，当移到Cl离子区域时，高电压消失，蛋白质的移动速度慢下来，当以上稳定状态建立后，蛋白质样品在快慢离子间被浓缩形成一个狭小的之间层，并按蛋白质所带负电荷量的多少依次排列成带，浓缩样品，从浓缩胶进入分离胶后，胶的pH升高，Gly的离解度增大，泳动率上升，又因为它分子小，故超过所有的蛋白质分子，紧跟在Cl离子后，Cl离子迁移后，低离子浓度不再存在，形成了恒定的电场强度，因此，蛋白质样品在分离胶中的分离主要取决于它的电荷性质，分子大小和形状，分离胶的孔径有一定大小，对不同相对质量的蛋白质来说，通过时收到的滞阻作用不同，即使静电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。

电泳缓冲液：Tris-甘氨酸缓冲系统：甘氨酸同Tris一起组成电泳缓冲液中的缓冲对，可以稳定电泳过程中的PH值。

保持待测蛋白处于磷酸化状态！在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制剂（NaF，可以防止去磷酸化），并将标本时刻保持在冰浴中！

使用5%的BSA作为封闭试剂，不能使用脱脂奶粉!（因为脱脂奶粉中含有酪蛋白，会出现很高的背景。）

蛋白的磷酸化是需要诱导的，当信号低或者无信号时有可能是磷酸化诱导不充分！确保使用阳性对照！