蛋白质的结构测定(一) 技术前沿 北纳生物

获得蛋白质的结构常用的有x线晶体学、NMR和电子显微镜三维重组等技术，x线晶体学可在原子分辨率水平上分析蛋白质的精细三维结构，是目前最主流，分辨率晟高的方法，因而是结构生物学最有效的手段，基于篇幅，这里只介绍x线晶体学。x线晶体学的关键在于是否能够获得高度有序的、衍射分辨率高于4A的蛋白质单晶。蛋白质结晶的第一步是选择合适的缓冲液溶解此蛋白以形成稳定的蛋白溶液，再加入沉淀剂促使蛋白溶液过饱和到结晶，因而蛋白的结晶经由三个阶段：①蛋白溶液的饱和；②过饱和并形成品核；③晶体生长。

影响蛋白晶体生长的因素包括：①蛋白纯度；②沉淀剂；③溶液pH值；④缓冲体系：⑤蛋白浓度；⑥有机溶剂；⑦盐类或离子；⑧去垢剂；⑨温度。蛋白结晶有三个特点：①结晶是一个反复实验的过程，没有一种理论能够保证晶体生欧；②每个蛋白都有不同的晶体牛长条件和特点，因而每个样品必须设计相应的实验：③很多因素影响晶体的生长，为了得到适合x线衍射的晶体，可能需要试验几百甚至上万个条件，尽管经验可大幅度减少试验数量，但大分子的结晶仍然非常耗时和烦琐。

气相扩散法(vapor diffusion)是目前最流行的蛋白结晶方法，如图4-4-1所示，含有沉淀剂的结晶缓冲液置于容器下方的大样品池中，蛋白液滴位于盖在容器上方的盖玻片上。蛋白液滴和结晶缓冲液形成密闭体系，它们之间通过空气扩散交换而达到平衡。在此过程中，蛋白质液滴中沉淀剂及蛋白质的浓度逐渐增加，达到过饱和状态，最终析出晶体。目前常用的气相扩散法包括悬滴法和坐滴法。此法的优点在于晶体生长的过程缓慢，蛋白有足够的时间在晶格中堆积，节省样品而且可有效利用储存空间。

如图4-4-2所示为一张蛋白晶体衍射照片，利用单波长x线照射在一定角度范围内旋转的蛋白质晶体，同时记录晶体对x光衍射的强度及衍射点的位置。这些强度可转换为结构测定中的结构网子的振幅。

收集到的原始衍射数据需要经过处理(processing)用于后续的结构解析。目前最常用的数据处理软件有HKL和XDS等。衍射数据的处理一般包括以下几个步骤：

第一步指标化(indexing)，以确定晶胞参数和格子类型，并预测全部衍射点的记录位置；

第二步整合(integration)，包括预定点位置的强度测量及适当背景值的估算；

第三步对称等效点的比例因子的校正和平均、归并(scaling)以给出一套独立数据，同时还需要校正随时间变化的晶体损伤及晶体外形不规则所造成的吸收效应的差别。

有些时候还需要考虑探测器及光源引起的偏差，以及进行特殊的吸收效应校正。后修正(postrefinement)可改善不完整衍射点(partiality)强度偏差的估计。强度数据最终归并后(scaling)数据处理软件会给出一系列的与数据质量相关的统计参数。

数据的质量对结构分析各阶段的重要性不言而喻。衡量一套衍射数据的质量有如下几个客观的标准：分辨率、衍射强度R因子、完整度、信噪比和丰度。分辨率越高，数据量就越大，根据此数据修正的结构就越精确可靠，确定一套数据分辨率的通用标准是：最高分辨率壳层(shell)的信噪比应大于2，完整度大于50％，Rmerge应低于50％。通常情况下，整套衍射数据的Rmerge不能大于20％，好的数据的Rmerge可以小到2％～4％。数据的完整性对初始相位及结构测定是很重要的，原始数据的完整度应超过80%，而且缺失数据在倒易空间中应随机分布。全部数据的丰度应在2～3以上，提高丰度通常会略增加数据的Rmerge，但这种情况下最终电子密度图的准确性反而会提高。

为了提高数据质量，用回摆法收集数据时应考虑如下因素：

①准直光束的大小应与晶体的尺寸相当或略小，挑选衍射能力强、衍射点均匀、镶嵌度小的单晶用于数据收集，仔细将晶体调在中心。

②晶体到探测器的距离在保证一定的分辨率前提下应根据晶胞的大小来决定，晶胞越大距离越远，避免衍射点的重叠。

③每幅画面的晶体回摆范围通常为0．25^。～1^。，晶体回摆范围小一些可以提高数据的信噪比，但还与晶胞大小、晶体镶嵌度有关，晶胞越大回摆范围应越窄，可以避免衍射点重叠，然而晶体的回摆范围如果小于晶体镶嵌度则既无法提高信噪比，也无法避免衍射点重叠。

④曝光时间取决于麈好的统计计数与x线下晶体有限的寿命之间的平衡。如果晶体耐受x线，增加曝光时间可以提高数据的信噪比，但曝光时间如果过大导致太多的衍射点发生过饱和现象则会降低数据质量；如果晶体不耐受x线则应减少曝光时间，这样可以相对多收数据，同时根据晶体的空间群和方位计算最佳数据收集策略，以在最小的回摆范围得到一套完整的数据。

⑤尽可能多地收集晶体回摆角度，提高数据的丰度以提高数据的准确性。

结构因子(F(hkl))从数学上可以表达为两个部分：振幅和相角。通过测量x线衍射点的强度可以得到振幅，但是得不到相角信息。由于结构因子相角的全部信息在收集数据时丢失，因此必须通过其他途径来得到它们的数值。确定相角是晶体结构分析中的核心问题。解析相角问题的方法通常分为两类：①无初始模型，需要在蛋白晶体中引入重原子，通过实验方法求解而得到的实验相角：②有初始模型，通过分子置换法将初始模型通过旋转和平移拟合到晶胞中相应位置从而计算得到的模型相角。