RNA 提取总失败，这些技巧请收好！

你是否也常常为 RNA 提取感到困惑，每次提取都在不断接受各种挑战，例如 RNA 降解、低产率、低纯度以及 DNA 污染等等。此外，还会遇到各种各样的样品，却找不到一个普适的方法来解决。

今天，我们就给大家分享下 RNA 分离技巧，特别是最大限度地回收高质量、无 DNA 的 RNA 的实践经验。

收集样品后稳定 RNA

RNA 是不稳定的，极易降解。许多样品含有高水平的 RNase，会快速降解 RNA。为了使之最小化，最好在采集时稳定样本中的 RNA。常用的样品稳定方法包括液氮快速冷冻、干冰乙醇浴或 -80 °C 冷冻室。然而，这些方法也有缺点，如核酸的冻融损伤。

最佳 RNA 稳定方法：

1. 在裂解缓冲液中立即溶解，使 RNase 失活 (如 TRIzol^®、RNA 裂解缓冲液等)，然后样品可以立即处理或冷冻保存；

2. 浸泡在稳定试剂中（如 DNA/RNA Shield），使核酸酶失活，并在环境温度下长时间保护核酸。适用于实地收集样本或处理珍贵的病人样本（例如组织活检、全血等）。

确保样品完全溶解

在 RNA 提取过程中，提高 RNA 产量和质量的最佳方法是保证样品完全裂解。然而，并不是所有的样本都对相同的裂解方案敏感。例如，血细胞（如淋巴细胞、PBMCs 等）和微生物细胞往往很难有效溶解，仅仅添加基于洗涤剂的裂解缓冲液可能并不够。

为了提高裂解效果，可以将裂解缓冲液与机械裂解步骤（研磨珠破碎）匹配，或者在裂解液上游加入酶裂解步骤（如蛋白酶 K、溶菌酶等）（图 1）。

图 1：从裂解缓冲液中提取大肠杆菌细胞的总 RNA，用研磨珠机械匀浆，而不是仅用裂解液进行裂解。在裂解液中进行机械均质化可产生稳定的 28S/16S 核糖体带和更高的核糖体完整性（RIN）。Agilent2200 TapeStation^®。

如何消除 DNA 污染

DNA 的存在会使基于 UV/VIS 的定量方法（如 Nanodrop）发生偏差，从而人为地提高 RNA 的定量，使其高于实际水平。

此外，在更敏感的下游应用（例如 RNA-seq）中，它还可能导致错误读数。这可以通过多种方法实现（例如 TRIzol^® 相分离、DNA 去除柱和 DNase 处理）。

确认 DNA 的存在的最快方法是使 RNA 样本可视化（如琼脂糖凝胶，AgilentTapeStation^® 等等）, 寻找 28S 核糖体 RNA 带上方的任何高分子量片段（图 2）。其他方法 , 如 qPCR 或 Qubit 也可以使用，如果您正在执行对 DNA 污染敏感的下游应用，则更可取。

图 2：用琼脂糖凝胶电泳显示人类上皮细胞的 RNA 谱。使用 ZYMO RESEARCH 试剂盒提取的 RNA 没有污染基因组 DNA，与供应商 Q 和供应商 P 相比，小 RNA 的回收率更高。

Zymo Research 开发了一种新型的 RNA 提取试剂盒，该试剂盒具有新的缓冲液和离心柱体系，可以结合和提取 RNA，同时消除污染的 DNA。RNA 分离试剂盒包括用于柱上处理的 DNase I。

这消除了提取后 DNA 酶处理和清理步骤的需要，并简化了从提取到下游应用的过程。下面的图 3 说明了基于 PCR 缺乏 DNA 扩增，ZYMO 柱对 Dnase 处理是有效的。

图 3：使用 Zymo Quick-RNA 试剂盒（绿色）分离的 RNA 与使用供应商 Q 试剂盒（虚线）分离的样品相比无 DNA。从 106 个人上皮细胞中分离总 RNA（对于两种试剂盒均进行柱上 DNase 处理）。每条扩增曲线代表三次独立分离实验的平均值。

针对不同类型样本推荐的 RNA 产品：

配合 TRIZOL 试剂的 RNA 提取

（含 microRNA）

本方法无需传统 TRIZOL 提取方法的相分离，而且不需要使用任何有毒有害的试剂（例如氯仿），7 分钟就可完成整个操作步骤并且可以提取到含 microRNA 的总 RNA。

01

先用 TRIZOL 或类似试剂裂解样品

本表格针对各种样品列出了参考用量，详细用量请参见说明书

• 细胞样品

针对细胞重悬液，添加 3 倍体积的 TRIZOL 到 1 体积的细胞悬液中。

• 组织样品

• 液体样品

02

纯化过程

1. 添加等体积的 100% 无水乙醇到 TRIZOL 的裂解物中混合；

2. 把混合物加到 ZYMO-SPIN IIC 柱上并且套在收集管里，离心，去除滤出液；

3. 可以采用柱上消化的 DNA 的步骤去除 DNA（可选）；

4. 添加 Direct-zol wash buffer 400 µL 到柱子上离心，去除滤出液；

5. 添加 RNA wash buffer 700 µL 到柱子上离心，去除滤出液；

6. 直接添加 50 µL of DNase/RNase-Free Water 到柱基质上，下面套上一个干净的 1.5 mL EP 管离心收集 RNA。