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外泌体是直径介于30-200nm的磷脂膜分泌型囊泡，经胞膜及核内体膜出芽形成，且富含特定蛋白质、脂质，核酸及糖复合物【1，2，3】。外泌体内含物的表达水平与细胞的种类及细胞健康病变状态息息相关，在细胞间的信息交流及疾病诊断方面，外泌体也有巨大的功能【4，5】。目前外泌体依旧是现在生物研究中，一个比较热门的话题。外泌体的提取方法目前有很多种，包括超速离心法、聚合沉降和特异性抗体捕获等【5】。这里跟大家简单介绍一下，外泌体提取过程中常用到的一些方法，以及各种方法的特点。 超速离心法是外泌体提取中最早建立并使用的一种方法【6】。这种方法原理就是通过外泌体与其他细胞器的沉降系数不同，将细胞、细胞碎片以及其他细胞器等，分离出去，从而得到纯净的外泌体。这种方法的优点就是外泌体提取方法简单，提取过程中不会引入其他的标记物，适合大剂量的样品处理。缺点是，操作繁琐，费时费力，操作过程中需要超高速离心。此外，由于离心力的因素，可能会导致外泌体结构破坏从而影响下游实验。 Fig 1：超速离心法（左图：超速离心法操作步骤；右图：外泌体电镜图片） 这是一种普通超速离心法（方法01）与密度梯度离心法结合的方法。由于外泌体的密度范围是1.13g/ml-1.21g/ml，可以使用梯度介质去除非囊泡颗粒。最开始使用的梯度介质为蔗糖，所以又称蔗糖密度梯度超速离心，在后来经过方法的不断改进，可以使用碘克沙醇作为新的一种高效介质。相比于普通的超速离心法，它可以通过使用蔗糖等介质更好的去除样品中大的蛋白质集体等杂质，从而得到更加纯净的外泌体。但是这种方法操作起来更加繁琐。 这种方法是通过高分子的疏水聚合物，如聚乙二醇（PEG），它可以改变外泌体的溶解性和分散性，使其能够在比较低的离心力下沉降出来。其原理可能与竞争性结合游离水分子和PEG本身形成的网状结构有关。这种方法的优点就是操作起来比较简单，不需要超速离心机，得到的外泌体数量较多，也适合大剂量的样品处理。但是这种方法提取得到的外泌体，杂质含量会比较多，尤其是一些杂蛋白。 Fig 2：聚合物沉降法原理 这种方法主要是利用多孔的凝胶球，通过分子大小不同将外泌体纯化出来，其原理类似层析法纯化蛋白。在分离提取过程中，大分子物质不能进入凝胶孔，很快沿多孔凝胶间的缝隙被流动相洗脱出来，而小分子物质能进入凝胶孔，滞留时间更长，会更慢地被洗脱出来。外泌体的分子粒径大于一般的蛋白分子，所以外泌体会先被洗脱下来，而粒径小的蛋白质会被后洗脱下来，从而分离出高纯度的外泌体。优点就是纯度相对较高，且外泌体结构不易受到破坏。缺点就是如果有一些大小相近的颗粒也会被纯化出来，比如乳糜微粒、低密度脂蛋白等。 Fig 3：分子排阻法原理 这种方法是将溶剂及小分子物质过滤到膜的另一侧，而将相对大分子物质截留在超滤膜上，以达到分离的目的。外泌体直径范围40～200 nm，我们用超滤膜经过长时间的低速离心就可以分离样本中的外泌体。这种方法的优点是操作方便，富集效率比较高，易于搭配其他膜或操作，并且成本较低。缺点是过膜易损耗变形，导致膜堵塞，纯度较低，大颗粒蛋白污染严重，并且在洗脱过程中，附着于膜上的外泌体难以回收，导致提取损失。 Fig 4：超滤法原理 外泌体表面带有许多特殊的膜蛋白质，如CD9、CD63、CD81和ANNEXIN等，可以将这些外泌体标志蛋白作为分离外泌体的特异性标记。将抗体固定于磁珠等基质上，利用相应性抗体与这些标志蛋白之间的特异性相互作用，以实现对外泌体的特异性富集。这种方法的优点是外泌体纯度较高，并且对外泌体膜结构影响较小。缺点就是成本较高，无法进行大剂量的提取，并且磁珠保存难度也比较高。 Fig 5：磁珠特异性捕获法原理 参考文献 1. Clotilde Théry, L. Zitvogel , and S. Amigorena . 'Exosomes: composition, biogenesis and function.' Nature Reviews Immunology 2.8(2002):569-579. 2. Yáñez-Mó M, et al. Biological Properties of Extracellular Vesicles and Their Physiological Functions. J. Extracell. Vesicles. 2015; 4:27066. 3. György B, et al. 'Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.' Cellular and Molecular Life Sciences 68.16(2011):2667-2688. 4. D. Michiel Pegtel and Stephen J. Gould. 'Exosomes.' Annual Review of Biochemistry. 88(2019): 487–514. 5. Shao, Huilin , et al. 'New Technologies for Analysis of Extracellular Vesicles.' Chemical Reviews(2018):acs.chemrev.7b00534. 6. Clotilde Théry, et al. 'Isolation and Characterization of Exosomes from Cell Culture Supernatants and Biological Fluids.' Current Protocols in Cell Biology 30.1(2006). 亲爱的小伙伴们，以上是本期的全部内容，希望此次文章对您的科研有所帮助，我们下期见。 |
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