4 其它

4.2  超高速離心法：		TOP ▲
a. 沉降係數	蛋白質分子在離心時，其 分子量、分子密度、組成、形狀 等，均會影響其沉降速率，沉降係數 即用來描述此沉降性質； 其單位為 S (Svedberg unit)，每一種蛋白質的沉降係數與其分子密度或分子量成正比。 不同沉降係數的蛋白質，可利用超高速離心法，在密度梯度中作分離。	■ 超高速離心的沉降係數
b. 密度梯度作法	一般有三種製作梯度的方式： (1) 在樣本溶液中直接溶入 CsCl，經離心後自動形成梯度。 (2) 使用梯度製造器，在離心管內預先拉好 甘油 或 蔗糖 的梯度，加樣本後離心。 (3) 在一極為熟悉的離心操作中，以上亦可以 階段式 (stepwise) 梯度進行。
c. 兩種離心方式	上述 (1) 及 (2) 二者，分屬兩類不同的離心形式，列表並以圖解說明如下︰
表 4.1 兩種超高速離心方式的比較：
圖 4.1  高速離心與兩種超高速離心法的比較
d. 離心陀種類	使用不同離心陀，有不同離心方式及效果。 (1) 角型 (angle rotor)： 典型的離心方式，多用在大量製備時。 (2) 懸籃式 (swing bucket rotor)： 傳統用在密度梯度離心。 (3) 垂直 (vertical rotor)： 取代懸籃式，可大大縮短離心時間。 (4) 區帶 (zonal rotor)： 在梯度離心後，可直接分劃出各區帶樣本。 (5) 連續式 (continuous rotor)： 可一邊離心，一邊加入或取出樣本。
e. 操作注意	超高速離心因為轉速極高，離心陀構造也較複雜，操作上要非常小心，完全純熟後才進行實驗，新手要有熟練者在旁指導。 操作時特別注意下列各點： (1) 離心管的平衡要準確，封管要確實，否則液体可能被抽乾。 (2) 使用懸籃式離心陀，在懸掛離心管時，要注意有沒有掛妥。 (3) 轉速切勿超過所使用離心陀的最高限，老舊者的最高限還要打折。 (4) 離心後要清理離心陀，可用水沖乾淨後晾乾；尤其使用 CsCl 者，非洗不可。 (5) 時常檢查離心艙及離心陀，注意有無腐蝕及傷痕，有者立刻請廠商檢修。
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4.3  超微薄膜過濾法：		TOP ▲
a. 超微薄膜過濾技術 (ultrafiltration, UF)	(1) 使用具有極細孔徑的薄膜，可以分離分子量不同的分子；薄膜上的小孔，只能讓某分子量以下的分子通過，此分子量稱為該薄膜的 cut-off。 (2) 其基本原理類似透析，但 UF 薄膜的孔徑則更細，而且可選擇孔徑大小。 應用這種薄膜技術的方式很多，主要用在 濃縮、脫鹽 及 無菌過濾。 (3) 另外在純水的製造上，以薄膜配合 逆滲透 (reverse osmosis, RO) 所製成的管柱，可除去水中 90% 以上的離子。
b. 超微膜濃縮裝置	因樣本体積的大小不同，有各種不同的微膜設計，常用者如下： (1) 空心管 (hollow fiber)： 微膜薄層鋪在堅固空心小管的內側，當樣本通過空心管時，小分子則由側面擠出，比較不會有局部過濃的問題。 (2) 多層側流板 (tangential-flow)： 多層微膜疊在一起，溶液流動方向與微膜平面成平行，小分子由側向微膜擠出，無局部過濃的問題。 (3) 攪拌加壓過濾 (stirred cell)： 加壓迫使分子濾過微膜，並在薄膜表面攪動，以防止局部過濃而阻塞微膜細孔。 (4) 振動濃縮子： 可直接浸入含有樣本的試管中進行濃縮，微膜平敷在濃縮子表面，以振動去除局部過濃現象，沒有無效体積，故樣本損失量較低。 (5) 微膜離心管： 離心管中橫置一微膜，利用離心力把小分子擠過，大分子留在上方；樣本數目多而體積少時，多採用此法。
c. 其它濃縮方法	除了上述之超微薄膜系統之外，另有其他常用的濃縮方法︰ 硫酸銨沉澱、冷凍乾燥、透析袋濃縮、電泳溶離、真空冷凍離心、氮氣吹乾等。 注意其中有些方法，在濃縮後鹽濃度會提高，而使用超微薄膜則無此缺點。 圖 4.2 比較各種濃縮方法的使用体積及範圍；實驗室較常用的是 Stirred cell, Centricon (Centriprep) 及 SpeedVac。
圖 4.2  各種濃縮方法的使用範圍比較