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Schumacher CA, Joiner DM, Less KD, Drewry MO, Williams BO. Bone Res. 2016 Mar 1;4:15042. 首先在本研究中，研究者繁殖并鉴定了col2a1-cre介导的Lrp5/ Lrp6条件性基因敲除小鼠。与WT小鼠对比，敲除Lrp5或者 Lrp6的小鼠均可以保持正常的发育和生长，膝关节在形态学上未发现异常，但如果在col2a1-cre介导下同时敲除Lrp5及Lrp6基因，小鼠在胚胎发育期会出现严重的骨骼发育缺陷。而且，敲除Lrp5和/或Lrp6的小鼠均表现为骨量降低，这说明软骨细胞在分化为成骨细胞后，成骨细胞中仍然具有col2a1-cre活性。在胚胎骨骼发育和成年鼠骨量的建立中，LRP 5和LRP 6具有冗余功能。 Mice carrying Collagen2a1-cre-mediated deletions of Lrp5 and/or Lrp6 were created and characterized. Mice lacking either gene alone were viable and fertile with normal knee morphology. Mice in which both Lrp5 and Lrp6 were conditionally ablated via Collagen2a1-cre-mediated deletion displayed severe defects in skeletal development during embryogenesis. In addition, adult mice carrying Collagen2a1-cre-mediated deletions of Lrp5 and/or Lrp6 displayed low bone mass suggesting that the Collagen2a1-cre transgene was active in cells that subsequently differentiated into osteoblasts. In both embryonic skeletal development and establishment of adult bone mass, Lrp5 and Lrp6 carry out redundant functions. Wnt/β-catenin信号通路影响细胞迁移、增殖和分化，是骨骼发育的关键调节因子。保守的 Wnt/β-Catenin 通路调节干细胞的多能性，并且在发育过程中决定细胞的分化命运。这种发育性级联整合其他通路的信号，包括视黄酸、成纤维细胞生长因子 (FGF)、转化生长因子 β (TGF-β) 和骨形态发生蛋白 (BMP)，存在于各种不同的细胞类型和组织。Wnt 配体是一种分泌型糖蛋白，可结合 Frizzled (卷曲）受体，然后与 LRP5/6 一起在细胞表面形成一个更大的复合体。（下图为补充材料，来自CST官网） 大量研究表明，WNT/β-catenin水平的改变可能影响软骨细胞的分化和/或功能，例如，β-catenin在软骨细胞系细胞中的异位表达抑制了软骨细胞的分化。wnt/β-catenin信号上调可能抑制sox 9的表达和活性，从而减少软骨细胞的分化。此外，既往的研究表明，退行性骨关节炎模型观察到β-catenin信号的增加和减少。临床OA患者细胞中LRP 5 mRNA和蛋白表达增加，LRP 5基因多态性分析表明LRP 5基因多态性与OA相关。 在过去的十年中，研究者利用基因工程小鼠模型来了解Wnt通路在骨骼发育中的作用，研究发现LRP6的种系缺失导致与轴向骨骼和四肢骨骼缺陷相关的新生小鼠致死。组织特异性和杂合子LRP 6失活突变在发育早期产生的骨骼表型通常比LRP 5突变的小鼠更为严重。 该研究中，研究者利用cre-loxp系统繁殖了col2a1-cre介导的LRP 5或LRP 6单基因条件敲除小鼠，以及LRP 5和LRP 6双基因条件敲除小鼠。 Figure 1、 研究者采用等位基因特异性PCR（是指利用引物与模板之间的碱基错配可以有效地抑制PCR反应，进而达到模板区分（等位基因区分）的目的）确定col2-cre活性形式，结果表明在col2-cre；Lrp5fl/fl 小鼠的肋骨，股骨和软骨中检测出了突变片段，而在col2-cre；Lrp6fl/fl 小鼠中， 尾巴，肋骨，股骨和软骨中均检测出突变片段。为了进一步证实cre的重组活性，研究者把col2-cre转基因鼠杂交成一条链携带了mT/mG 的cre报告鼠。这种报告鼠在没有cre时，tomato蛋白得以表达，表现出红色荧光，当暴露在cre重组酶作用下，绿色荧光蛋白得以表达，原理如下图（补充图片来源于：A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse），col2-cre小鼠中，GFP在肥大性软骨细胞、骨小梁区和皮质骨区均有表达，提示cre重组。 Figure 2、 研究中发现，在col2-cre介导下，Lrp5及Lrp6纯合双敲除的小鼠会出现胚胎致死，于是研究人员便按照时间点对小鼠进行合笼交配，以在E18.5天胎鼠致死前取出胚胎，外观上敲除和对照胚胎之间并无明显差异，而进行胚胎的阿尔新蓝-茜素红全骨架染色后发现，WT与Lrp5及Lrp6纯合双敲除的胚胎之间的骨骼发育形态学上出现差异。 Figure 3、 在col2-cre；lrp5fl/fl；lrp6fl/fl胚胎中，枕骨未矿化，c1椎体和c2椎体背弓发育不良，这些变异胚胎的外枕骨较小，舌骨的原始体软骨骨化较小，椎骨内有间隙，同时也观察到腭部缺乏骨生长和融合，鼻骨膜骨化减少的现象。在Col2-cre、lrp5fl/fl、lrp6fl/fl胚胎的脊柱和肋骨内，椎体突起较小，矿化减少。 Figure 4、 Col2-cre；lrp5fl/fl；lrp6fl/fl小鼠改变了骨骼发育过程中的软骨带。从图中增加的阿尔新蓝染色可以看出，E18.5天的col2-cre；lrp5fl/fl；lrp6fl/fl小鼠胚胎肢体出现弯曲，肥大软骨细胞距离生长板延伸的更远。 Figure 5、 为探讨Col2-cre引起的LRP 5或LRP 6敲除对6月龄成年鼠骨骼的影响，采用双X线吸光度法测定全身骨密度，结果表明雄性和雌性Col2-cre；lrp5fl/fl和Col2-cre；lrp6fl/fl小鼠的骨密度明显低于对照组。Col2-cre;Lrp5fl/+;Lrp6fl/+, Col2-cre;Lrp5fl/fl;Lrp6fl/+，Col2-cre;Lrp5fl/+;Lrp6fl/fl的雌鼠和雄鼠骨密度也明显降低、股骨远端小梁数和骨体积分数定性减少，小梁间距增加。雄性和雌性col2-cre；lrp5fl/fl和col2-cre；lrp6fl/fl的皮质横截面积和皮质厚度均明显低于各自的WT，雌性小鼠皮质矿物质密度明显低于WT。LRP 5和LRP 6突变的雄性和雌性小鼠皮质厚度和矿物质密度显著降低。 Figure 6、
lrp 5或lrp 6功能单独缺失和LRP 5/6功能杂合和完全缺失的双重组合成年小鼠膝关节软骨和软骨下骨正常，WT小鼠与突变小鼠膝关节形态无明显差异。与WT相比，col2-cre；lrp5fl/fl、lrp6fl/+和col2-cre；lrp5fl/+、lrp6fl/fl小鼠关节软骨中Safranin o染色强度略有降低，所有小鼠关节软骨均有完整潮线，软骨厚度无明显差异。 Figure 7、
在微计算机断层扫描(MicroCT)上，突变小鼠和WT小鼠膝关节软骨下骨形态相似，没有软骨下骨侵蚀或骨赘形成等退行性关节疾病的病理证据。 研究表明wnt/β-catenin信号与人类和小鼠退行性关节疾病有关。Col2-cre介导的lrp 5缺失的小鼠具有正常的膝关节，这并不令人惊讶，因为以前证明lrp 5的全身敲除并不会有骨骼的形态学改变，然而，LRP 6纯合失活会导致胚胎致死，因此以前无法评估LRP 6失活对成年鼠膝关节的影响，Col2-cre介导的lrp 6缺失没有任何明显的膝关节表型。此外，col2-cre；lrp5fl/fl、lrp6fl/+和col2-cre；lrp5fl/+、lrp6fl/fl小鼠也表现出正常的膝关节形态。由于这两种基因的纯合缺失导致胚胎死亡，因此无法评估双重缺失对携带全身缺失的成年小鼠膝关节的影响。我们认为这与以下观点是一致的：在col2-cre表达细胞的后代中至少保留lrp 5或lrp 6的一个等位基因足以介导正常的关节发育。或者，也可能并不需要来自LRP 5或LRP 6的信号来进行正常的关节发育，未来的研究将评估LRP 5和LRP 6如何调控来自Wnt的下游信号通路，这些通路是骨骼组织正常发育所必需的。
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