外泌体(Exosome)是由细胞分泌而来的微小囊泡，直径约为30-150 nm，密度在1.13-1.21g/ml，具有杯状形态、双层膜结构。外泌体天然存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基等生物体液中，包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞（免疫细胞、神经细胞、干细胞)，都可以产生并释放exosome。
Exosome能够运载其内源性的脂质、核酸、蛋白质、miRNA等信息物质参与细胞间通讯和机体的生理代谢过程，被认为是细胞间通讯、疾病诊断和预后循环生物标志物的重要载体，外泌体通过其携带的脂质、核酸、蛋白质等来调节受体细胞的生物学活性，从而参与机体免疫应答、细胞迁移、肿瘤侵袭、抗原提呈等生物学过程。此外，外泌体还可以作为“天然的纳米粒子”来进行药物递送，装载的药物类型包括小分子化学药物、蛋白质和肽、核酸药物等，总之，外泌体在临床和治疗方面展现出了极具前景的研究价值。
图中看出，自2015年以来，国自然基金中外泌体相关的项目数量及资助金额均以非常快的速度在直线递增。从详细统计数据来看，截至今天2019年的外泌体相关的国家自然科学基金中标总计已达2.13亿元，较2018年1.69亿元增长26%，2018较2017年1.23亿元增长37%，这些数据表明外泌体已成为生命科学/基础医学研究的一大热点。
外泌体的分离方法有很多种，常用的有超速离心法、免疫磁珠法、试剂盒分离法、密度梯度离心、过滤离心法等。
Ø 超速离心法：超速离心法是大家最熟悉的一种分离方法，文献中应用最多且也是目前比较受到认可的方法。超速离心是先通过低速离心去除细胞和细胞凋亡碎片，再通过超高速去除大囊泡和沉淀外泌体。此方法耗时耗力，往往需要8-30个小时；且需要大量的起始材料和超速离心机；产量不高。
Ø 免疫磁珠法：利用外泌体表面特有的表面标记物（如CD63、CD9蛋白），用包被抗标记物抗体的磁珠与外泌体囊泡孵育后结合，即可将外泌体吸附并分离出来。该方法具有特异性高、操作简便、不影响外泌体形态完整等优点，但外泌体的生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游实验。
Ø 试剂盒分离法：外泌体分离试剂盒通过简单离心，从体液、血液、尿液、细胞中分离外泌体（Exosome），相比超速离心，安全、快速，经过两次柱子纯化，很好的去除了白蛋白，从而获得高纯度和高产量的外泌体。但目前商业化的外泌体提取试剂盒多种多样，提取效果良莠不齐，同时试剂盒本身的价格比较高，因而不是性价比高的一种分离方法。
鉴定外泌体可从其物理特征到表面分子标志物等多个角度来展开。以下分享几种常用的鉴定方法：
该方法适用于外泌体双层囊膜超微结构的观察，用于鉴定样本中是否存在外泌体样结构，通常呈一侧凹陷的半球形或茶托型。
在外泌体研究领域中NTA技术已被认可为外泌体表征的重要手段之一。该技术的样本处理过程简单，能保证外泌体的原始状态，且检测速度快，检测后能提供外泌体的粒径以及浓度信息。
Western Blot可以鉴定样本中是否存在外泌体的标志蛋白。CD9、CD63、HSP70、TSG101是外泌体常用的标志蛋白。即先对外泌体进行荧光标记，再通过流式细胞仪来检测外泌体表面的标记蛋白。根据外泌体的表面标志物（如CD9、CD63）来进行ELISA实验，通过检测外泌体的蛋白量，从而实现对外泌体的分析。
下游分析方面，分离纯化出来的exosome可以开展基因测序、蛋白分析以及代谢检测。
>>RT-PCR：通过PCR可以分析需要研究指标的表达量；
>>转录组分析：通过测序或者芯片，分析Exosome不同基因的转录水平；
>>miRNA：通过测序或者芯片，检测与Exosome相关的miRNA的表达情况，研究特定的miRNA；
>>lncRNA分析：通过测序或者芯片，检测与Exosome相关的lncRNA的表达情况，研究特定的lncRNA与Exosome共同调控某种疾病的关系；
>>SDS-PAGE：可分析得到的Exosome中蛋白的含量及种类。
>>Western-Blot：通过Western-Blot可以检测Exosome中特定的蛋白表达情况。>>2-DE等蛋白组学分析：可以了解Exosome中不同蛋白的表达、数量情况
全谱代谢组：通过LC-MS检测，了解Exosome中所含有的代谢物种类，并通过定量分析，研究差异代谢物与病理生理机制之间的关系。
样本要求：外泌体分离后建议进行NTA计数（推荐>107），保证各样本的一致性。
外泌体代谢组研究有哪些文献可参考？
1. Altadill T , Campoy I , Lanau L , et al. Enabling Metabolomics Based Biomarker Discovery Studies Using Molecular Phenotyping of Exosome-Like Vesicles[J]. PLoS ONE, 2016, 11(3):e0151339.
2. Maija P , Maarit T , Maria-Elisa N , et al. Metabolomic Profiling of Extracellular Vesicles and Alternative Normalization Methods Reveal Enriched Metabolites and Strategies to Study Prostate Cancer-Related Changes[J]. Theranostics, 2017, 7(16):3824-3841.
3. Xian L , Mingrui A , Cuneo K C , et al. High-Performance Chemical Isotope Labeling Liquid Chromatography Mass Spectrometry for Exosome Metabolomics[J]. Analytical Chemistry, 2018:acs.analchem.8b01726-.
