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陈祎霏a 翻译；曹彦硕b 审校 a 北京大学肿瘤医院乳腺内科;b 北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科 本文刊选自2019年第3期《肿瘤学年鉴中文版-胃肠肿道瘤专刊》，经授权在聚焦oncology 上发表。本文为全文翻译，文字有删减，如需阅读全文，请与编辑部联系。 摘要：肿瘤免疫治疗的出现需要发现、验证以及随后采用严谨的、敏感性和特异性俱佳的预测和预后生物标志物用于日常实践。本文将讨论液体活检在免疫肿瘤学（I-O）中如何预测患者对免疫检查点抑制剂（ICI）（PD-1/PD-L1和CTLA-4抗体）治疗的反应、复发及不良事件，并着重于近期的进展。循环肿瘤细胞（CTCs）、游离DNA（cfDNA）、血浆中检测到的蛋白和细胞因子以及循环T淋巴细胞是潜在的新的I-O生物标志物。cfDNA的量化作为疗效预测标志物以及cfDNA测序对于肿瘤突变负荷（TMB)的测定已获得较好进展。虽然目前液体活检还未被纳入I-O临床实践中的常规检查，但近期有前景的数据和快速发展的技术预示着其可能很快使接受ICI治疗的肿瘤患者能够获得个体化临床管理。 关键词：免疫治疗，液体活检，循环肿瘤细胞，循环核酸，PD-L1，生物标志物 目前，免疫治疗在多种肿瘤的治疗中进展迅速。例如，近期Keynote-024和-89报道的在进展期和转移性非小细胞肺癌引人瞩目的总生存（OS）结果提示，需要坚持对预后和疗效预测的生物标志物的评估、使用与发展。 至今，组织切片的免疫组化（IHC）PD-L1表达是唯一可作为伴随诊断的一线免疫治疗疗效预测性生物标志物。PD-L1免疫组化的一大问题是，作为一项疗效预测性生物标志物，它在肿瘤内和肿瘤间的表达具有异质性。因此，小的活检标本中（如气管镜或经胸穿刺）可能会低估PD-L1状态，而不能代表整个肿瘤。相应的，有些患者会因为组织采样偏倚而未能接受免疫治疗。 近来，作为一项有前景的全新的生物标志物，组织检测的肿瘤突变负荷（TMB）被应用于多瘤种中，也在接受纳武利尤单抗和依匹木单抗联合治疗的非小细胞肺癌患者前瞻性的用于评估分层。TMB单独或联合PD-L1 IHC结果已被证明对晚期非小细胞肺癌免疫治疗的疗效有不错的预测价值，也被认为在其它肿瘤中有相同的有效性。 尽管ICI疗效的预测指标的研究获得了一些进展，目前仍存在许多挑战。首先，由于缺少组织和/或组织样本中肿瘤细胞百分比过低，可能无法运用PD-L1免疫组化和/或TMB测定预测疗效。第二，即便在一些高TMB且肿瘤细胞PD-L1阳性的患者中，免疫治疗仍会失败，这体现了肿瘤免疫病理学的复杂性以及我们对这一学科尚未完全理解。最后，由于肿瘤对治疗策略的适应性，在患者随访期间可能需要反复检测这些生物标志物。 近些年来液体活检发展成为多种肿瘤，尤其是胸部肿瘤的疗效预测性生物标志物。液体活检是一种非常具有吸引力的检测手段，其损伤小、成本效益高、并能够快速为临床医师提供与决定治疗决策相关的信息（图1）。重要的是，在治疗过程中可以重复进行液体活检来追踪患者，如可以探查微小残留病灶、复发以及耐药机制。 ▲ 图1. 肿瘤免疫治疗液体活检的合适靶点。如上图所示，所有液体活检的靶点在临床应用中都有不同的优缺点。 液体活检所使用的液体主要是血液，但也会使用脑脊液、尿液来做生物检测。不同成分，如循环游离DNA（cfDNA）或更特异的循环肿瘤DNA（ctDNA），以及循环肿瘤细胞（CTCs），还有蛋白质、外泌体和其它循环囊泡都可以用于液体活检分析。另外，也可以从血液样本中获得T细胞并分析。尽管既往认为T细胞不属于液体活检，但由于近年来T细胞在免疫肿瘤学领域的应用有较高需求，也一并在本文进行讨论。 基于目前液体活检在靶向治疗获得的有希望的结果，以及在基线和免疫治疗中能快速监测疗效的预测性生物标志物的潜在优势，将液体活检纳入免疫肿瘤学领域的越来越多的努力并不令人意外。另外，免疫治疗耐药的出现也促进了能够在治疗中以有限的损伤来进行分析的生物标志物的发展。 这篇综述总结了液体活检在肿瘤ICI治疗的新进展。讨论了每种检测方式的优缺点以及如何在未来实践中应用的前景。 免疫检查点蛋白的表达是动态的，受多种微环境、炎症、治疗因素的影响。而CTC来源于多处肿瘤，理应比组织样本能更好地反映PD-L1表达的全貌。 CTC可以通过抗原依赖的方法分离，CTC会通过特异性抗原（最常见的是上皮细胞黏附分子EpCAM）过滤出来，如CellSearch 系统（Menarini Silicon Biosystems）、Epic 平台（Epic sciences）或Gilupi CellCollector（Gilupi）。 另外，根据CTCs的大小、变形能力，以及与特定基因的表达相独立、抗原非依赖的分离方法也已出现。举例来说包括按肿瘤细胞大小的分离方法（ISET, Rarecells Diagnostics）、CellSieve （Creatv MicroTech）、Parsortix （Angle PLC） 、Vortex VTX-1（Vortex Bioscience）或ClearCell FX device（Biolidics）。 基于EpCAM丰度的检测方法可以对大和小CTC进行检测和分类。然而正在经历上皮-间质转化（EMT）的细胞会丢失EpCAM表达，因此会被这类检测方式遗漏。 根据肿瘤类型，PD-L1表达强度高的CTC上皮-间质转化程度更高，因此只能通过非抗原依赖的检测方式测出。但是，基于形态学而不基于EpCAM的CTC分类有其他局限性。比如，表达PD-L1的循环巨噬细胞和有些循环髓源性抑制细胞（CD45-，cytokeratin+，PD-L1+）都可能被错认为PD-L1阳性的CTC。 检测CTC的PD-L1表达已经在肺癌、膀胱癌、乳腺癌、头颈部鳞状细胞癌、结肠癌和前列腺癌等实体瘤进行过评估（表2）。除了上述技术问题，也迅速出现了其他挑战：（1）PD-L1是在所有CTC中表达，还是仅表达于CTC的某一亚型？（2）PD-L1在CTC的表达是否与组织活检匹配？（3）PD-L1在与CTC相关的循环免疫细胞中的表达有什么意义？（4）基线水平与治疗后随访中PD-L1在CTC的表达是否与免疫治疗预后及疗效预测相关？ 首个评估CTC中PD-L1表达的研究是通过EpCAM依赖的CellSearch方法和B7-H1 PD-L1单克隆抗体在乳腺癌患者中进行的。研究共纳入了16名转移性乳腺癌患者，CTC的PD-L1表达在11/16（68.8%）PD-L1阳性的患者中有很强的异质性。这项最初的研究为在其他实体瘤中研究CTC中PD-L1的表达开辟了途径。Adam等的一项研究通过非抗原依赖过滤的方法（CellSieve）识别出表达PD-L1的不同类型的CTC。有些被定义为“正在经历上皮-间质转化的循环肿瘤细胞亚型（EMTCTC）”，有些是“病理学可定义的预后相关性循环肿瘤细胞（PDCTC）”，一些较大的循环巨噬细胞被描述为“肿瘤相关巨噬细胞样细胞（CAMLs）” 。41名非小细胞肺癌患者中，CAMLs（EpCAM-，CK+，CD45+，CD14+）和EMTCTC（EpCAM-，CK+，CD45-，CD14-）分别在81%和49%的患者中检测到，而PDCTC的检出率（EpCAM+，CK+，CD45-，CD14-）仅占2%。有趣的是，放疗后PD-L1在CTC中的表达升高与RAD50双链断裂修复蛋白（DMA损伤修复的生物标志物）的升高相关。在这种情况下，有必要进行序贯治疗的临床试验，首先进行放射治疗（或化疗），然后进行免疫治疗，以探究CTCs中PD-L1的增加是否可以作为这些治疗有效的生物标志物。然而相反，最近一项研究显示在ICIs治疗后循环肿瘤细胞PD-L1在CTCs的表达下调。 Guibert等人分析了96名化疗后接受免疫治疗的晚期非小细胞肺癌患者，其中90%以上的细胞角蛋白阳性CTCs有恶性特征。PD-L1（在有D8T8X克隆的CTC和具有 E1L3N克隆的组织中）在CTC（83%）中的表达明显高于组织样本（41%），并且在每份标本间不相关。令人意外的是，CTC中PD-L1阳性的患者对纳武利尤单抗的应答率低于阴性患者。在另一项纳入71名晚期非小细胞肺癌患者的研究中，Ilie等人使用ISET方法检测出的CTC和免疫细胞PD-L1状态（SP142克隆），并对比了同一个月内配对的胸部标本。在这项研究中，PD-L1在循环肿瘤细胞以及匹配的组织活检中的表达有较好的相关性。 尽管结果大相径庭，免疫治疗后PD-L1表达阳性CTC的持续存在被认为与预后不良相关。现在亟需前瞻性临床研究，以评估CTC中PD-L1表达在初始治疗决策和监测疗效中的应用。遗憾的是，由于CTC较少见，且不同检测方法可能会导致不同CTC亚型检出比例不同，CTC中 PD-L1的检测仍然面临着技术挑战。因此，相关研究间可能没有可比性，尤其是将抗原依赖型及抗原非依赖型检测方式进行比较的时候。 除了CTC，cfDNA，或更精确一些，循环ctDNA，是液体活检最重要的来源，因此cfDNA在免疫肿瘤学方面的应用已经取得一些进展。重要的是，近几年从血液中提取cfDNA的技术有很大进步，一些检测cfDNA基因组变化的分析已经用于日常实践。至今，cfDNA/ctDNA的整体定量、血液TMB（bTMB）检测以及不稳定性拷贝数正被探索用于肿瘤免疫治疗。 在ICIs治疗的转移性黑色素瘤中，无进展生存期（PFS）较短的患者（<6月）基线ctDNA水平更低，而且会随着治疗中肿瘤负荷的增加而升高。近期的研究已证实在转移性黑色素瘤中纵向cfDNA检测的实用性。另一项包括非小细胞肺癌、脉络膜黑色素瘤、微卫星不稳定性结直肠癌的前瞻性研究中，接受抗PD-1 ICI治疗8周后检测到ctDNA相比于未检测到ctDNA的患者，存在明显更短的PFS（中位PFS 11月对比2月，HR=10.2）和OS（HR=15）。由于在基线及治疗8周后没有检测到ctDNA的患者结局最好，这为治疗开始前检测ctDNA提供了理论基础。 有趣的是，Jensen等利用cfDNA检测和基因组不稳定数（GIN，越高表示拷贝数变化越多）预测ICI在不同肿瘤中的疗效。虽然基线cfDNA和GIN不能预测反应，但是治疗中GIN下降可以预测有治疗反应的患者，同时也可以用来发现假性进展。 由于遗传分析中cfDNA的易得性，且TMB作为新的组织学生物标志物在肿瘤免疫治疗中取得了有希望的结果，通过测定cfDNA评估TMB是有前景的，可以扩大它在原始标本较少、或组织样本检测TMB质量有限情况下的应用。 一项新的研究提示高bTMB可以预测非小细胞肺癌免疫治疗的有效性。虽然这项研究使用了靶向测序组合（FoundationOne®， Foundation Medicine, 剑桥），但在此之前，已经做过循环DNA的全基因组测序。bTMB可以改善某些肿瘤中的患者分层。然而，bTMB检测需要足量、高质量的DNA，不一定每次都能获得。另外，bTMB的界值以及确切的基因检测组合还有待明确，并需要进一步验证和标准化。bTMB似乎独立于组织TMB，因此需要评估患者分层的新阈值。 此外，检测cfDNA中不同突变可以评估肿瘤动态变化，并且可能对肿瘤患者免疫治疗分层有所帮助。例如，在非小细胞肺癌患者中，丝氨酸/苏氨酸激酶11（STK11）突变与对免疫治疗无应答个体密切相关。所以，cfDNA中STK11突变的检测可以帮助筛选无应答患者，目前对这些检测的验证正在进行。 存在高度微卫星不稳定性（MSI）的肿瘤也可以通过基于cfDNA的检测检出，一项近期的研究说明了cfDNA中高染色体不稳定性与不同瘤种中免疫治疗的良好疗效有关。值得注意的是，这可以区分超进展和假性进展的患者。 重要的是，血液中的基因组分析，如bTMB、STK11突变的评估，分析时需谨慎。因为检测基因突变的组合包含许多与克隆造血相关的的突变，可能得出误导性结果，需要在生物分析中注意剔除。 与在肿瘤组织和CTC中一样，PD-L1和PD-1也可以在实体瘤患者的血浆或者血清中测定（表3）。研究发现，通过对这些蛋白在基线和/或后续随访中的水平进行比较，发现抗PD-1/PD-L1治疗的有效性与血浆可溶性PD-L1（sPD-L1）相关，其水平升高与预后不良相关。 然而，选择循环蛋白质作为免疫治疗疗效预测性生物标志物存在几个问题：（1）如何确定好的治疗反应临界值；（2）检测应该用哪些方法；（3）如何区分由于非肿瘤性疾病或某些生理状态引起的循环PD-1、PD-L1蛋白升高。 炎性、过敏性、自身免疫、感染性疾病和糖尿病都可以引起血浆PD-L1升高，因而影响这项检测作为ICI治疗疗效预测性生物标志物的应用（表3）。此外，某些生理状态（衰老和怀孕）也与血浆PD-L1水平升高相关。 另外，与外泌体结合的PD-L1也可以在人类血浆中检测，或许会成为重要的生物标志物。它可以与免疫细胞上的PD-1结合，主动抑制CD8+淋巴细胞。抗PD-1治疗前更高的外泌体PD-L1浓度与黑色素瘤患者预后不良有关。这可能是一种比可溶性PD-1/PD-L1更可靠的检测手段。 近期一项研究表明血浆高水平IL-8对免疫治疗有效性的预测价值。在黑色素瘤及非小细胞肺癌患者接受免疫治疗的一个小队列中，应答的患者治疗后IL-8迅速下降。此外，治疗前血管内皮素-2升高与接受ICI治疗的黑色素瘤患者OS降低相关。然而这一结果只在接受依匹木单抗联合贝伐珠单抗的患者中有统计学意义，在依匹木单抗单药治疗中并未看到统计学意义。 有趣的是，Weber等基于119份不同治疗史的转移性黑色素瘤患者的血清样本建立了预测蛋白特征。通过MALDI-TOF分析209份血清蛋白，可以识别出难治性患者，并可区分于治疗敏感的患者（HR=0.37）。虽然这项检测独立于年龄、性别和PD-L1表达，它与血清乳酸脱氢酶水平以及基线肿瘤大小显著相关。 除了通过检测血浆蛋白质对ICI治疗患者进行分层以及预测治疗结局，Lim等建立了一种基于血浆细胞因子的预测黑色素瘤患者ICI治疗相关不良事件的方法。他们应用11种细胞因子建立了一个预测免疫相关不良事件的评分（CYTOX评分），曲线下面积分别为0.7和0.68，突出了细胞因子分析在肿瘤免疫治疗中可以满足多种要求。 最后，在免疫肿瘤学领域有一些有关T细胞分析的试验颇有前景。T细胞可以很容易的通过密度离心从患者血液中分离出来，进一步采用流式细胞学方法（使用荧光或磁性珠子）可分离出CD4+和CD8+细胞。此外，它们可以在保留全部功能的情况下被分离出来，因此可以用于功能性研究（图2）。 ▲ 图2. 免疫肿瘤学中基于T细胞的检测。由于易于从血液中分离，基于T细胞的液体活检是免疫肿瘤学中一个新的、引人注意的靶点（但T细胞也能从肿瘤切片中获得）。每个T细胞亚群都由独特的T细胞受体（TCR）定义，TCR主要由一条α和一条β链组成（本文不讨论γδT细胞），并且易于通过对互补决定区3（CDR3）测序进行区分。这允许以相同的新抗原特异性，来确定由不同T细胞亚集数量定义的TCR集和由T细胞集的浓度定义的TCR缩窄。 循环淋巴细胞PD-1表达，举例来说，与黑色素瘤和肾细胞癌的新抗原特异性T细胞有关。另外，T细胞受体（TCR）集，定义为有不同TCRs的T细胞数量，近年来成为免疫肿瘤学新的生物标志物。在大部分T细胞中，TCR由一条α和一条β链编码（除了γδT细胞）。每条链包含3条超变异区（互补决定区，CDR）。CDR1区和CDR2区的变异由胚系突变决定，CDR3区的变异是由基因重组带来的（V(D)J连接）。因此每个TCR的CDR3区都是独特的，对这一独特的结构区进行测序可以鉴别TCR集。 已发展出几种方法，同时对黑色素瘤患者扩张的循环T细胞的分析表明其与肿瘤新抗原负荷相关，并且可能作为帕博利珠单抗治疗应答潜在的生物标志物。Hogan等人的研究中应用PCR技术研究TCR的CDR3区域，结果显示抗PD-L1治疗前基线水平更多单克隆TCR与黑色素瘤PFS延长相关，而相似的TCR谱却与抗CTLA-4治疗较短的PFS相关。这提示我们抗PD-L1治疗与抗CTLA-4治疗机制不同，并且应该对不同治疗组的患者进行独立分析。但是在另一项研究中，黑色素瘤CTLA-4抑制的确可以增加TCR，但是对临床应答没有影响。尽管在抗CTLA-4治疗患者中见到矛盾的结果，TCR缩窄（将TCR集缩窄到普通氨基酸序列）已经在几种瘤种中作为抗PD-1/PD-L1治疗的疗效预测性生物标志物被研究。虽然大多数情况下研究的是CD8+ T淋巴细胞，正如Rosenbergde开创性的研究描述的，CD4+调节T细胞也可以使用这种方法。另外，这种检测方式也可以运用在肿瘤组织，进一步的研究一定能够为组织或外周血T细胞在ICI治疗患者分层的应用打开局面。 免疫肿瘤学时代里，液体活检应用的研究正如火如荼，一些有希望的结果必将会快速转化到临床常规实践。因为液体活检可以在疾病进程中比较容易地多次重复，这可以帮助随访以及评估治疗效果。 cfDNA定量目前是最先进的技术，bTMB测定也是用作患者免疫治疗初始分层很有希望的方式，可以逐渐完善。然而，bTMB的测定尚未标准化，仍需要前瞻性临床研究来验证其预测价值。 CTC的免疫细胞学特征无疑是另一个有趣的方法，允许我们评估免疫检查点抑制剂效应相关的重要蛋白。虽然cfDNA和循环肿瘤细胞PD-L1表达的测定很有前途，但先进的技术，TCR集及T细胞缩窄的测定也获得了有趣的结果，可能会成为评估ICI应答的实用工具。 目前符合可及性、可重复性、敏感性、特异性和性价比的要求限制着液体活检向临床实践的转化。未来，联合检测多种靶点（比如cfDNA和CTC）可能成为液体活检在免疫肿瘤学领域的优选方案。为了实现这些目标，EU/IMI（欧盟/新药）联合体已经成立，其包括来自学院及企业的40个研究机构。 总体来讲，液体活检尚未成为免疫肿瘤学的日常实践，但颇有前景的数据和快速发展的技术预示着这项技术可能使接受ICIs治疗的肿瘤患者获得个体化临床管理。 参考文献（略） 原文出处：Hofman, P., et al., Liquid biopsy in the era of immuno-oncology: is it ready for prime-time use for cancer patients? Ann Oncol, 2019. 30(9): p. 1448-1459. 本文刊选自2019年第3期《肿瘤学年鉴中文版-胃肠肿道瘤专刊》，经授权在聚焦oncology 上发表。本文为全文翻译，微信版有删减，如需阅读全文，请与编辑部联系。 专家介绍 曹彦硕，医学博士，北京大学肿瘤医院消化肿瘤内科 主治医师。 2011年毕业于北京大学；2013年于北京大学肿瘤医院完成住院医师培训2014-2015年任住院总医师；2016-2018年于Princess Margarete Cancer Centre, Toronto, Canada完成Clinical Fellowship。主要专业方向为消化道肿瘤的内科治疗及临床研究 译者介绍 陈祎霏，北京大学医学部博士，北京大学肿瘤医院乳腺内科 住院医师。 |
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