云序客户解密快速发表5分文章秘籍之RNA甲基化测序篇

文章导读

如何快速发表5分左右文章，这是很多科研工作者头痛的问题，确实SCI 文章5分是个坎，尤其临床医生平时临床忙成狗，哪有时间做实验，功能不想做，机制不想做，有没有创新套路？都说m6A RNA甲基化测序很火，做个测序就能发文章（案例一/案例二），那么，m6A RNA甲基化赶迟了怎么办？天下武功唯快不破，m5C RNA甲基化表达谱教你如何快速发表5分左右文章。

首先介绍一下，什么是m5C RNA甲基化？

m5C RNA甲基化是胞嘧啶（C）的第五位N上加上甲基的一种修饰（C5-methylcytidine，m5C），它是近年来发现的一类在tRNA及rRNA高丰度存在的甲基化修饰，利用高通量测序手段已验证其在非编码RNA及mRNA中也广泛存在。目前已证实其功能涉及调控干细胞应激、细胞毒性应激、mRNA出核和植物细胞发育及基因表达等方面。

下面小编为大家解析一篇云序客户发表的关于m5C RNA甲基化的表达谱文章。该研究主要探究了m5C RNA甲基化转移酶（NSUN2）对mRNA m5C甲基化修饰和基因表达的影响。下面看一下作者是怎么研究的？作者利用CRISP/Cas9技术构建NSUN2-/-HEK293细胞系，并利用m5C RNA甲基化测序和RNA-Seq（云序提供以上服务）检测mRNA中m5C的修饰水平和基因表达水平。该研究一共检测到1185个修饰位点和790个表达发生改变的基因。进一步生信分析揭示，发生m5C甲基化修饰能够调节基因表达，并且这些差异表达基因能够显著富集到与细胞增殖相关的信号通路上。同时作者还发现，下调NSUN2能够显著抑制HEK293细胞的增殖和迁移，其中GRB2和CD44可能是NSUN2调节细胞增殖的关键调节因子。该研究进一步阐述了NSUN2调控HEK293细胞增殖和迁移等生物学功能的分子机制。

发表期刊：Epigenomics

影响因子：4.404

实验方法：m5C RNA甲基化测序、RNA-Seq（云序生物提供以上服务）

全文链接：Effects of NSUN2 deficiency on the mRNA 5-methylcytosine modification and gene expression profile in HEK293 cells

文章内容

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NSUN2影响m5C在HEK293细胞中整体分布情况

NSUN2被报道是RNA甲基转移酶，能使tRNAs和mRNA发生m5C甲基化修饰。为了探究NSUN2对HEK293细胞mRNA m5C甲基化修饰的影响。作者利用CRISP/Cas9技术敲减NSUN2（NSUN2-/-HEK293细胞）后进行RNA-BisSeq。经过生信分析，发现在HEK293细胞有12442个m5C位点，在NSUN2-/-HEK293细胞中有3270个m5C位点，在注释mRNA中分别有1142个和376个m5C甲基化位点（A）。且NSUN2下调能够降低m5C甲基化程度（B）和部分染色体上m5C位点数目（C）。但是，NSUN2下调并不改变m5C位点的motif偏好性，HEK293细胞中，CG含有22%，CHG含有33%，CHH含有45%；NSUN2-/-HEK293细胞中，CG含有24%，CHG含有33%，CHH含有43%（C、D）。这些数据显示，NSUN2能够影响m5C位点在HEK293细胞中的分布。

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NSUN2调节的差异m5C mRNA的功能预测

为了进一步探究NSUN2如何影响HEK293细胞功能。作者对发生差异m5C mRNA（DMGs ）进行了GO和KEGG注释分析。GO注释显示这些DMGs与转录起始、mRNA分解代谢过程、RNA剪接、RNA输出、mRNA稳定性调节及基因表达均有显著相关（A）。KEGG分析显示与核糖体、剪接体、RNA运输和凋亡通路以及PI3K-Akt信号通路显著相关（B）。这些结果说明，NSUN2调节的m5C甲基化可能通过RNA的合成和翻译，进一步影响基因表达水平。

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NSUN2对mRNA的表达水平的影响

为了探究NSUN2调节的m5C RNA甲基化对mRNA表达水平的影响，作者对NSUN2-/-HEK293和HEK293细胞进行了RNA-seq。结果显示有790个差异表达的基因（DEGs），其中467 个上调，323 个下调（A）。为了进一步探究NSUN2对这些DEGs功能的影响，作者对DEGs进行了GO和KEGG注释分析。GO注释显示这些DMGs与细胞黏附、神经系统发育、细胞表面受体信号传导、细胞分化、细胞增殖均有显著相关（B）。

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NSUN2能够调节HEK293细胞的增殖和迁移

有研究报道NSUN2能够促进一些癌症细胞的增殖和迁移。为了进一步探究，NSUN2对HEK293细胞增殖和迁移的影响，作者进行MTT、克隆形成和划痕实验。结果显示下调NSUN2能够抑制HEK293的增殖（A，B）和迁移（C）。

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NSUN2能够恢复NSUN2-/-HEK293细胞增殖和迁移能力

为了证明NSUN2确实影响HEK293细胞的功能，作者在NSUN2-/-HEK293细胞中过表达NSUN2后（A），进行MTT和划痕实验。结果展示NSUN2能够恢复NSUN2-/-HEK293细胞增殖和迁移（B-C）。   

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与细胞增殖和迁移相关的差异基因的表达谱

以上结果都证明NSUN2与HEK293细胞的增殖和迁移相关。为了探究与其相关的基因，作者通过GO注释，发现了86个 DEGs与增殖相关（D）、57个 DEGs与迁移相关（B）、32个 DEGs与增殖和迁移相关（C）。    

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PCR验证与增殖和迁移相关的差异表达的基因

为了探究测序的可靠性，作者通过PCR探究了7个与增殖和迁移的关键基因（FN1, CD44, GRB2, TGFB1,ITGA3, THBS1的表达，跟测序结果一致（A）。同时，发现NSUN2能够恢复NSUN2-/-HEK293中CD44, GRB2的表达（B）。这说明测序数据是可靠和可信的。

总结

RNA甲基化依然是当下生命研究竞相追逐的科研热点，本文作者的研究思路跟m6A的典型研究模式异曲同工。作者从m5C 甲基化酶（NSUN2）出发，并对其进行干预后，进行m5C RNA甲基化测序和RNA-seq，然后将表观转录组学和转录组学进行联合分析，探究该酶调控的靶基因，从而探究NSUN2通过影响基因表达参与HEK293细胞功能的调控。这种方法对于探究酶调控的靶基因，简单快捷高效，且多组学联合分析，文章内容丰富，可呈现的信息多样，是目前通过酶研究甲基化的一大利器，受到众多科研工作者的追捧。