|
前面我提到了有学员提问： 新的ngs流程该如何学习之m6A学习大纲，所以我给了他优秀学员想要MeRIP-Seq/m6A-seq教程，但是他似乎是并没有主动给我投稿，不过我们的转录组授课讲师也感兴趣了这个技术，想丰富一下课程内容，所以开启了这个系列学习哈！ 文章信息文献标题：m6A RNA methylation impacts fate choices during skin morphogenesis 发表杂志：eLife(IF7.551) 发表时间：26 August 2020 原文doi：10.7554/eLife.56980 关于作者-Samie R Jaffrey 他是m6A研究领域的大佬之一，关于他最有名的可能是2015年发表的那篇第一次在单碱基水平鉴定了m6A修饰的方法文章[Nat Methods. 2015 Aug;12(8):767-72]。 个人介绍主页：https://research./researchers/samie-jaffrey 文章摘要N6-甲基腺苷是哺乳动物中最主要的RNA修饰。本研究中，作者通过研究小鼠皮肤胚胎发生这一过程来追踪m6A的功能和生理重要性。
实验设计m6A miCLIP测序：测序：50bp paired 预处理：Grozhik et al., 2017 m6A位点识别：CIMS analysis was analyzed with seqLogo/R package Normalized-to-input uTPM over identified m6A sites：GenomicRanges Bioconductor/R package m6A sites 注释：ChIPseeker package 外显子，CDS，UTR区域注释：GTF，GenomicFeatures Bioconductor/R package 每个转录本的SN-uTPM ：the sum of signal for all normalized-to-input uTPMs within the exons of a specific transcript m6A site可视化：Olarerin-George and Jaffrey, 2017 m6A水平的GSEA：fgsea Bioconductor package ，mSigDB中的C2和C5 单细胞测序：使用FACS分离control and cKO samples中YFP+ epidermal cells (上皮细胞) Chromium Single Cell 3’ 建立文库，NextSeq 500测序。 使用Cellranger (version 2.1.1) 得到COUNT，Seurat2.3.4 进行数据整合和分析。 细胞过滤：去掉了表达<1800 genes的cell和<10 cells的gene。 细胞注释：使用已知markers。 时序轨迹分析：monocle (version 2.10.1) 差异表达分析和GSEA分析：MAST (version1.8.2, Finak et al., 2015) miCLIP and ribosome profiling之间的相关性分析：使用核糖体RNA测序评估翻译效率。主要结果1.m6A高度修饰的转录本参与毛囊形态发生首先，作者使用单碱基水平的miCLIP测序评估了生理条件下小鼠表皮细胞中mRNA的m6A修饰的位置和程度。 miCLIP测序结果概况：
基于以上几点，m6A测序结果表明：有大量的mRNA具有m6A修饰，但是m6A修饰的这部分mRNA的GSEA分析结果显示并没有某一个功能类的富集打分超高。然而，WNT和SHH途径在多个最高富集类别中出现的这一事实表明m6A可能在促进毛囊命运中起作用。2.表皮祖细胞中Mettl3基因低或不表达导致毛囊形态发生出现明显缺陷先来看看Mettl3基因是何方神圣：RNA甲基化修饰过程主要与三类蛋白相关（图A）：
在哺乳动物mRNA中，m6A修饰存在于7000多个基因中，保守基序为RRACH (R = G, A; H = A, C, U)。m6A修饰富集在mRNA终止密码子附近。大多数细胞的RNA 的m6A修饰主要靠METTL3-METTL14复合物进行添加，而Mettl3 or Mettl14的不表达会使细胞内的m6A修饰大量减少。 因此，为了研究m6A缺乏对皮肤形态发生的影响，作者设置Mettl3基因敲除小鼠实验：Mettl3 conditional knockout (cKO) mice。 在整个胚胎发生过程中，对照组和cKO小鼠在外观上大致相当(图D)。 然而，从出生后第2天(P2)开始，Mettl3基因敲除小鼠的表型就开始出现异常。**最明显的是，与对照组相比，它们的体型和体重都在逐渐下降，并且大多数都活不过6天。**为了调查致死性原因，首先排除了脱水导致的死亡，然后口腔组织检查发现牙齿和舌头都已经形成，但是此时为哺乳和食物摄入所必需应该出现的舌状丝状乳头并没有形成。cKO小鼠的背部皮肤毛囊形态也发生了明显变化。 基于这些数据，Mettl2基因缺陷似乎并未反映出发育延迟，而是改变了形态。在这方面，舌丝状乳头和皮肤HF缺陷这一结果尤其有趣，因为它们的形态发生均需要WNT和SHH信号传导。 至此，作者似乎找到了m6A修饰与皮肤毛囊发生之间的关联性：WNT和SHH信号传导。3.接下来，作者通过单细胞测序分析了m6A缺失引起的转录组层面的变化：m6A的丢失导致了毛囊谱系单细胞转录组内的扰动我们通过单细胞RNA测序确定m6A的缺失对全局基因表达的后果。 单细胞测序：4443 control cells and 3455 Mettl3 null cells。基于已经发表的markers，tSNE分析产生7个主要的clusters。
7个cluster的markers的热图展示。 为了评估谱系分化轨迹，我们对对照和cKO转录组均进行了时序分析，时序分析结果： 对于对照皮肤组，大多数细胞沿着两个主要分支：
而在cKO中，与表型异常相一致，沿HF分支( hair follicles branch)的WNT^hi^细胞的数量显着减少。
4.其他结果我们还观察到了METTL3缺失会引起信号通路和经典翻译起始因子下调，METTL3缺失后出现了相应的补偿机制，METTL3缺失后上调的那部分RNA代谢增强，即表现出高m6A修饰的mRNA通常在METTL3丢失后上调而不是下调。
总结尽管对m6A修饰在mRNA降解和翻译中所起作用的分子机制的了解越来越多，但仍然不清楚这种丰富的修饰如何影响组织生物学。这篇文章的研究发现了一些有关m6A行为的新见解，并在结合和增进我们对先前体内和体外研究中出现的某些重复出现主题的认识方面取得了进展。重要的是，这篇文章使m6A修饰成为干细胞命运选择和翻译控制的关键整合者。 可以说是结合了目前的热点单细胞技术手段进行m6A相关功能研究的一篇文章吧。使用的是热点基因（甲基化转移酶METTL3）敲除+单细胞，并不是单细胞甲基化研究，目前好像还没有看到单细胞在表观层面上的相关技术研究，也可能是我看的文献太少了吧。 文末友情推荐 |
|
|
