免疫组织化学染色Q&A（上）

来源：衡道病理

近年来，免疫组化在肿瘤诊断和鉴别诊断中的实用价值受到了普遍的认可。由于免疫组化染色过程中存在许多步骤或环节，每一步操作都可能影响到染色的最终结果，因此，把握好免疫组化的染色过程意义重大。

　　为大家整理一些关于免疫组化染色中经常遇到的问题和处理方法。希望能帮助老师们解决日常工作中遇到的问题。

　　产生组织切片非特异性染色的原因有哪些？ 如何解决？

　　1、抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。 这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。 这是最重要的一条。

　　2、一抗用多克隆抗体易出现非特异性着色，建议使用单克隆抗体看看。

　　3、内源性过氧化物酶和生物素在肝脏、肾脏等组织含量很高（含红血球较多的组织），需要通过延长灭活时间和增加灭活剂浓度来降低背景染色。

　　4、非特异性组分与抗体结合，这需要通过延长二抗来源的动物免疫血清封闭时间和适当增加浓度来加强封闭效果。

　　5、DAB 孵育时间过长或浓度过高。

　　6、PBS 冲洗不充分，残留抗体结果增强着色，在一抗 / 二抗 /SP 孵育后的浸洗尤为重要。

　　7、标本染色过程中经常出现干片，这容易增强非特异性着色。

　　免疫组织化学染色呈阴性结果的原因有哪些？

　　1、抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误。不是抗体浓度越高就越易出现阳性结果，抗原抗体反应有前带和后带效应，必须测试最佳浓度。

　　2、抗原修复不全，对于甲醛固定的组织必须用充分抗原修复来打开抗原表位，以利于与抗体结合；建议微波修复 用高火 4 次 *6min 试试。 有人做过实验，这是最佳的时间和次数。 若不行，还可高压修复，或是电饭锅修复(阳春实用的方法)。

　　3、组织切片本身这种抗原含量低。

　　4、血清封闭时间过长。

　　5、DAB 孵育时间过短。

　　6、细胞通透不全，抗体未能充分进入胞内参与反应。

　　7、开始做免疫组化，建议一定要首先做个阳性对照片，排除抗体等问题。

　　石蜡切片和冷冻切片的比较？

　　1、要求做冷冻切片的不一定能做石蜡切片。因为做石蜡切片时要高温烤片，可能会破坏组织的抗原性，如果组织的抗原性较稳定，则可作石蜡切片；但是要求做石蜡切片的，可作冷冻切片。

　　2、冷冻切片的优点是能够较好的保存组织的抗原免疫活性，做免疫组化时不需抗原修复这一步。 缺点是细胞内易形成冰晶而破坏细胞结构，可能会使抗原弥散；切片厚度较石蜡的厚，做的片子没石蜡的漂亮。 当你买一抗时，目录上都写着做什么样的切片，如果它写着只能做冷冻，就不能做石蜡，如写着两者都可，那就都能做。

　　3、石蜡切片的优点可以保持组织细胞的形态结构，且容易存放在室温，而冷冻切片比较麻烦，一定要存在-80 度的低温冰箱中，尤其是用来做原位杂交的的切片，为了防止 RNA 降解，保存一贯很重要。

　　4、石蜡制作的切片，可以制成极薄的切片，一般的切片厚度要求在3-5微米，而石蜡切片不但可以达到这个要求，甚至可以切得更薄到2微米以 至1微米，所以原位杂交探针容易渗透到组织中去，容易成功，而且得到的颜色/形态都较冷冻切片好。

　　如何选择一抗？

　　1、单克隆和多克隆抗体的选择。 由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体。 单克隆抗体能目标明确地与单一的特异抗原决定位结合，就像导弹精确地命中目标一样。 另一方面，即使是同一个抗原决定位，在机体内也可以由好几种克隆来产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。 在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高， 但易出现非特异性染色（可以通过封闭等避免）。

　　2、应用范围的选择。 有的一抗只能用于 Western blotting，或免疫组化、免疫荧光、免疫沉淀等；甚至标明石蜡切片或冷冻切片。

　　3、种属反应性的选择（ species reactivity ）。 这一点很重要，表明这种抗体可能存在种属差异，且这种抗体适合检测哪种种属动物体内的抗原。

　　4、种属来源，一般兔来源的多是多克隆抗体；而小鼠来源的多是单克隆抗体，但也有例外。 根据此来源来选择相应的二抗。

　　5、供货商的选择。

　　封闭血清(Blocking buffer)的选择原则是什么？

　　1、膜上或切片上有剩余的位点可以非特异性吸附抗体，造成后续结果的假阳性。

　　2、封闭血清一般是和二抗同一来源的，血清中动物自身的抗体，预先能和组织中有交叉反应的位点发生结合，否则在后面的步骤中如果和二抗发生结合，会造成背景。

　　3、可以用小牛血清、 BSA 、羊血清等，但不能与一抗来源一致。

　　4、可用BioTnA Immunoblock 有效降低背景，避免非特异性染色干扰。

　　抗体孵育条件的比较？

　　1、一抗孵育温度有几种： 4 度、室温、 37 度，其中 4 度效果最佳；孵育时间：这与温度、抗体浓度有关，一般 37 度 1-2h ， 4 度过夜（从冰箱拿出后 37 度复温 45min ）。

　　2、二抗一般室温或 37 度 0.5-1h ，具体时间需要摸索。

　　DAB 显色时间如何把握？

　　1、DAB 显色时间不是固定的，主要由显微镜下控制显色时间，到出现浅棕色本底时即可冲洗。

　　2、DAB 显色时间很短（如几秒或几十秒）就出现很深的棕褐色，这很可能说明你的抗体浓度过高或抗体孵育时间过长，需要下调抗体浓度或缩短你的抗体孵育时间。

　　3、此外，若很短时间就出现背景很深，还有可能你前面的封闭非特异性蛋白不全，需要延长封闭时间。

　　4、DAB 显色时间很长（如超过十几分钟）才出现阳性染色，一方面可能说明你的抗体浓度过低或孵育时间过短（最好一抗4度过夜）；另一方面就是封闭时间过长。