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YBIO钰博生物 01/免疫组化原理 免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)是一种综合定性、定位和定量；形态、机能和代谢密切结合为一体的研究和检测技术。在原位检测出病原的同时，还能观察到组织病变与该病原的关系，确认受染细胞类型，从而有助于了解疾病的发病机理和病理过程。 作用：通过颜色来显示蛋白质的有无、定位（胞外、胞膜、胞浆、胞核）、含量变化 样本种类： 按来源：①组织；②培养细胞 按制作方式：①石蜡片②冰冻片③细胞片 免疫组化/荧光图 YBIO钰博生物 02/免疫组化流程图 YBIO钰博生物 03/免疫组化实验步骤 固定的目的是为了使蛋白质凝固，减少或终止内源性/外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，保存组织或细胞内的抗原性。现在常用的固定剂有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液。有些固定剂对特殊组织有更好的效果，如苦味PLP固定液对于含糖组织保存更好，Helly固定液对于胰岛和垂体效果较好等。 脱水用梯度乙醇（由低到高）充分脱水，对于一些易脆的组织应减少高浓度酒精里的停留时间，透明的时间也应该控制缩短。对组织浸蜡时，一般选用56℃-58℃熔点石蜡，浸蜡温度最好不超过60℃，防止抗原的损失。包埋时应果断迅速，切片时注意检查刀片是否出现缺口，防止；蜡带出现裂痕。 使组织恢复到固定后的正常状态暴露抗原，方便与一抗结合。若脱蜡与水化不完全易出现局灶性反应和浸洗不完全，产生非特异性背景着色。 由于组织在甲醛或多聚甲醛在固定中，发生蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定簇。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定簇重新暴露，提高抗原检测率，常用方法通常使用高压加热修复，使用高压加热修复对修复温度和时间的把握十分重要，温度越高修复时间越短，温度与修复时间呈负相关。修复结束后注意室温冷却，让蛋白自然复性。另外，大家尽量使用过量的抗原修复液，防止高温液体挥发干涸，对切片造成不可逆影响。 传统的免疫组化法容易受到内源性过氧化物酶和生物素的干扰，必须对其进行灭活和封闭。灭活内源性过氧化酶一般用3%过氧化氢灭活10min左右，用甲醇配制过氧化氢更适合于保护抗原和固定组织。 血清封闭的目的是为了一抗与组织的非特异性结合，造成假阳性，一般会采用BSA、羊血清等封闭这些位点，封闭血清一般是和二抗同一来源的，室温封闭10-30min。 不同的一抗浓度，孵育时间和温度等对染色结果往往有较大的影响。在4℃下，反应缓慢，背景较浅；而37℃反应较快，时间较短；室温介于两者之间，二抗一般室温孵育30min。 检测背景的深浅和特异性染色的深浅基本上都以DAB孵育条件决定。DAB的显色时间并不是固定的，主要方法是使用显微镜控制显色时间，到出现特异性染色较强且出现背景着色较浅时就可以冲洗。如果DAB显色时间过长（超过十分钟）才出现阳性染色，可能是一抗体浓度过低或者封闭时间过长，也可以加入金属离子来增强显色（如硫酸铜、氯化钴、硫酸镍铵等）；如果DAB显色时间过短颜色就很深，这可能是一抗过高，需要下调抗体浓度，如果短时间内过深。 免疫组化染色后为了衬托出组织形态结构有必要进行复染，常用试剂为Mayer’s苏木染色，一般为2 min左右，DAB在核蛋白着色的时间可以适当缩短，最后用氨水或PH 8.0的TBS返蓝。 在封片阶段我们通常是用中性树胶来进行，封片过程中注意斜靠盖玻片防止气泡的产生从而对结果进行营影响，建议最好在通风橱操作，这样有利于气泡排除干净，不影响后续的镜检。 YBIO钰博生物 04/免疫组化常见问题分析 1）烤片时间不够，或温度不够，可以延长烤片时间和提高烤片温度； 1）组织边缘与玻片粘贴不牢，边缘组织松脱漂浮在液体中，每次清洗不易将组织下面试剂洗尽所致. 解决办法：制备优质的胶片（APES或多聚赖氨酸），切出尽量薄的组织切片，不厚于4微米，组织的前期处理应规范，尽量避免选用坏死较多的组织； 1）抗体孵育时间过长、抗体浓度高易增加背景着色。这可通过缩短一抗/二抗孵育时间、稀释抗体来控制。这是最重要的一条； 1）抗体浓度和质量问题以及抗体来源选择错误； 1）考虑一抗浓度高； （本文转自钰博生物） |
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