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编译：赵明，编辑：小菌菌、江舜尧。 原创微文，欢迎转发转载。 导读与红茶发酵实质为儿茶素氧化不同，普洱茶的发酵是一个以茶叶为基质的自然接菌的食品发酵过程，因而普洱茶则是与酸奶、泡茶等相似的发酵食品。我们根据普洱茶发酵系统中存在复杂而多样的微生物及演替，首次对普洱茶中发酵微生物组进行了系统性地研究。论文整合应用了扩增子测序、宏蛋白组和代谢组等多维宏组学技术，系统研究了普洱茶发酵菌群结构与变化、微生物组功能及代谢物动态变化，关联分析微生物群落及其酶参与的物质代谢，发现了微生物产生的与纤维素、木质素等茶叶多糖降解以及酚类物质代谢有关的关键酶，为进一步揭示普洱茶发酵核心微生物组的组成及功能，完善普洱茶发酵理论提供了有力的支撑。 原名：Integrated Meta-omics Approaches To Understand the Microbiome of Spontaneous Fermentation of Traditional Chinese Pu-erh Tea 译名：整合应用宏组学技术研究传统普洱茶发酵的微生物组 期刊：mSystems
IF：6.52 发表时间：2019.11.20 第一作者：赵明 发酵（Fermentation）是一种利用微生物的生长繁殖来加工食品的方法，人类已持续使用了数千年。通过发酵可改变食品营养结构、延长食品保质期等，目前常见的发酵食品包括酒精饮料、醋、泡菜、香肠、奶酪、酸奶、酱、面包等。据统计发酵食品占全球食品和饮料消费量的三分之一左右，在保障人类食品安全与饮食健康方面具有重要作用。目前传统食品发酵是一种自然接菌发酵过程，发酵中存在复杂而变化的微生物群落，这些微生物群落对发酵食品风味与安全密切相关。另外，研究发现食品发酵系统是一个良好的可重复的微生物相互作用研究模型，因此食品发酵中的微生物群落同时具有商业与科学价值。 目前微生物组学研究进入了多维宏组学时代，也即关联应用宏基因组、宏转录组、宏蛋白组和代谢组学技术进行研究，同时研究微生物的基因、转录本、蛋白和代谢物，以系统获得微生物群落结构与功能知识。这些多维宏组学技术已经应用于肠道、水体、土壤等微生物组研究。普洱熟茶是指以晒青毛茶为原料经过渥堆发酵加工而成的散茶或紧压茶。渥堆发酵是普洱熟茶加工的关键环节，是将晒青毛茶潮水加湿渥堆，并适时翻堆、潮水数次的过程。从食品加工或食品微生物学来看，晒青毛茶潮水渥堆是典型的微生物发酵过程，因此普洱熟茶是一种以茶叶为基质的发酵食品。前期学者应用纯培养方法和免培养方法研究发酵中的微生物群落结构与变化。前期，我们建立了宏基因组和宏蛋白学技术，研究了一个发酵样品。虽然，普洱茶发酵中的微生物研究由来已久，并且取得了重要成果，但是未从微生物组的高度进行研究，关于微生物的功能知之甚少。因此，我们在某企业进行了2次普洱茶发酵，收集了原料和发酵阶段样品，一共得到36份茶叶样品，分别进行了扩增子测序、宏蛋白组学、代谢组学、高效液相色谱测定分析，研究普洱茶发酵的微生物组，期望系统揭示发酵过程微生物组的组成与变化，微生物的酶组成与代谢活性，发酵过程代谢物的变化，并通过关联分析发现参与代谢物变化的酶，也即揭示发酵系统有哪些微生物？产生了什么酶？酶催化了那些反应导致茶叶成分变化（Fig 1）。
1 普洱茶发酵中的微生物组 从36个样品中一共得到了877,307细菌16S rRNA 基因和1,740,425真菌 ITS1片段序列。主成分分析显示，原料的真菌与细菌群落均与其它样品不同，表明随着发酵开始，菌群组成发生了显著变化；发酵末期样品细菌组成（B7,B8, M7, and M8）聚在一从，并与其它样品分开；然而末期样品(B8 and M8) 真菌群落组成与其它发酵样品(B1,B2, B3, M1, M2, M3, and M4)相似。概括的看，随着发酵进行，发酵B中，肠杆菌科细菌相对比例降低，而发酵M中，其相对丰度增加；在发酵末期，芽孢杆菌科细菌均增加，相对丰度达到了44.92% (B8) 和89.05% (M8)；另外，乳杆菌科细菌的相对丰度在B5和B6中超过了70%，而M1中假单胞菌科细菌相对丰度为46.56%(Fig 2)。和已有报道相似，我们在普洱茶发酵中观察到了肠杆菌科细菌相对比例降低，而芽孢杆菌科细菌丰度增加。优势真菌属于子囊菌门（Ascomycota），其相对丰度为84.76%–99.94%。两个原料的真菌组成不同，B0的优势真菌属于曲霉（Aspergillus）和德巴利酵母属（Debaryomyces），而M0的优势真菌为曲霉（相对丰度80.03%）。综合来看，曲霉(10.05–63.78%)、Rasamsonia(19.58–58.68%) 和嗜热丝孢菌（Thermomyces）(3.61–18.7%)是B4, B5, B6, M5, M6, and M7等样品的优势菌，而曲霉是其它样品的优势菌，相对丰度超过65%。 菌群共表达网络分析发现发酵中细菌与真菌相互排斥，如Bacillaceae, Pseudoalteromonadaceae, Comamonadaceae, and Enterobacteriaceae的OTUs与Aspergillus,Rasamsonia, Penicillium, Debaryomyes, and Saccharomycetes 的真菌OTUs负相关(Fig. 3). 
图2 普洱茶发酵中的微生物。细菌(A)和真菌(B)chao1，ACE和Shannon指数，细菌(C)和真菌(D)相对丰度的PCA分析。Circos图发酵中主要细菌科(E)和真菌属(F)的变化(相对丰度>1% )。每个样本中年其他科或者属所占比例则<1.0%。
图3 OTU共表达网络。(A)细菌之间的共表达网络。(B)真菌之间的共表达网络。(C)细菌与真菌的共表达网络。节点之间绿色的线代表负相关关系，红色的线代表正相关关系。
2 发酵中微生物功能概览 经过蛋白提取、酶解、LC-MS/MS测定分析和数据库检索，在发酵B和M中分别鉴定到4,623和6,505蛋白，如苹果酸脱氢酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等。GO注释统计发现主要蛋白的分子功能为催化活性（catalyticactivity）与结合（binding），主要的生物过程为细胞过程（cellularprocess）和代谢过程（metabolicprocess），主要的细胞组分为细胞部位（cellparts）和蛋白质复合物（protein-containingcomplex）。主要的酶的类别为氧化还原酶、转移酶和水解酶。一共注释到116 KEGG 代谢通路主要是糖酵解/糖异生、核糖体、氧化磷酸化和柠檬酸循环。富集到的代谢通路主要归类为细胞过程、环境信息处理、遗传信息处理和代谢，其中代谢类别主要包括氨基酸代谢、其它氨基酸合成和碳水化合物代谢。总的来说，本研究发现，微生物产生的酶主要参与细胞与代谢过程，主要富集到代谢与遗传信息处理途径，这些蛋白支持微生物的生长与繁殖。 3发酵过程代谢物变化概览 应用分光光度和高效液相色谱测定了发酵样品儿茶素、咖啡碱等16种茶叶特征成分的含量，分析显示上述成分呈现三种变化趋势：(1)茶多酚、游离氨基酸（FAA）、儿茶素（EGC、C、ECG和EGCG）、水解单宁(GG)含量降低；(2) 水浸出物（WE）、槲皮素、杨梅素、山奈酚和表儿茶素(EC) 含量初期升高，发酵结束后显著降低 (p<0.05)；(3)可溶性糖(SS)、没食子酸和鞣花酸含量显著增加(p<0.05)。另外发酵B中咖啡因含量显著增加(p<0.05)，而发酵M中变化不显著(p>0.05)。为了进一步探究发酵过程代谢物变化，以原料（B0和M0）、发酵中期样品（B4和M4）和末期样品（B8和M8）为材料，开展LC-MS/MS的非靶向代谢组学研究。一共检测到11,423 m/z信号，PCA分析发现原料(B0-1,B0-2, M0-1, and M0-2)、中期样品(B4-1, B4-2, M4-1 andM4-2) 和末期样品 (B8-1, B8-2, M8-1 andM8-2)代谢物不同。鉴定到298个相对含量显著差异的化合物，如芦丁、CG、EGCG等。从类别看上述化合物主要包括类黄酮(117 个),、甘油磷脂（56个）、脂肪酰（18）、羧酸及其衍生物（17个）。发酵后124（B8/B0）和125（M8/M0）个代谢物相对含量分别显著降低，其中64和57个代谢物降低大于10倍，包括EGCG、茶黄素-双没食子酸酯和茶氨酸等。另外55和52代谢物显著增加，如尿嘧啶、鞣花酸和没食子酸。
图4 代谢组分析结果。(A)光谱和高效液相色谱测得的物质的变化趋势。(B)代谢组分析检测到物质的PCA分析。(C)代谢物质倍数变化分布
4 碳水化合物活性酶分析 碳水化合物活性酶(CAZymes) 参与寡糖、多糖以及及糖基化合物（如核酸、蛋白、脂类、多酚等）等碳水化合物的组装与裂解。本研究发现了558个碳水化合物活性酶，包括糖苷水解酶、糖基转移酶、多糖裂解酶、糖酯酶、辅助活性酶、碳水化合物结合蛋白。其中，在发酵B和M中，分别发现了82和 137个可能与纤维素、木聚糖、木聚糖、果胶、淀粉、木质素、半乳甘露聚糖和几丁质等植物和真菌多糖降解有关的酶（Fig5）。如：葡聚糖酶、纤维二水解酶、葡萄糖苷酶和GMC氧化还原酶可能降解纤维素，过氧化物酶、芳醇脱氢酶、GMC氧化还原酶、胆碱氧化酶、醇氧化酶参与木质素的降解。我们认为发酵菌群产生碳水化合物活性酶，降解植物或真菌多糖成为单体或低聚物，进一步被菌群生长繁殖利用。微生物产生的这些酶，可以降解破坏茶叶细胞壁，导致茶叶变得柔软，并影响发酵样品多糖、果胶和可溶性糖含量。
图5 CAZymes分析结果。(A)普洱茶发酵中CAZymes家族概览。(B)参与降解多糖的CAZymes
除了多糖外，代谢组鉴定到了76个糖苷化合物，包括葡萄糖苷（31个代谢物）、鼠李糖苷（11个）、葡萄糖醛酸苷（9个）和葡萄糖苷（7个）等。发酵后，在36和33个糖苷化合物含量降低，而6和5个化合物含量增加。我们认为前面发现的糖苷水解酶和糖基转移酶可能参与糖苷化合物的降解与合成，导致其含量变化。如：葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶和1,3-β-葡聚糖糖基转移酶可能参与了葡萄糖苷的代谢；鼠李糖苷酶可能水解鼠李糖苷。 5 参与酚类物质代谢的酶 酚类化合物指具有一个或多个羟基的芳香环的化合物，通常分为酚酸、类黄酮、香豆素和单宁等。以儿茶素为主的酚类物质是茶叶特征成分，具有抗氧化、抗癌等多种生物活性，并且与茶叶口感密切相关。另外，红茶加工中儿茶素发生氧化产生茶黄素、茶红素等物质，与红茶品质密切相关。因此，理解酚类物质代谢是对认识茶叶加工机理与控制品质至关重要。通过代谢组发现了包括EGCG、GC、槲皮素等144个酚类物质。发酵后多酚总量与大部分酚类物质含量降低，而没食子酸和鞣花酸等部分物质含量升高，也即普洱茶发酵中酚类物质变化显著，我们进一步通过关联分析蛋白组与代谢物数据挖掘了部分与酚类物质代谢相关的酶。其中72个化合物是酚糖苷，如槲皮素3,7-二葡萄糖醛酸苷，如前所述，糖基转移酶和糖苷水解酶可能参与酚糖苷的代谢。21个化合物是EGCG等没食子酸酯，发酵中没食子酸酯的含量均降低。如，EGCG的含量从47.3 ± 2.42 mg/g (B0)和46.02 ± 2.81 mg/g (M0) 降低到 0.08 ± 0.15 mg/g (B8)以及未检出 (M8)。而没食子酸含量增加了11倍（Fig 6A）。单宁酶 (E.C: 3.1.1.20) 水解可溶性单宁的酯键断裂，如催化单宁酸形成没食子酸和葡萄糖。通过蛋白组发现了6个单宁酶以及3个单宁酶/阿魏酰酯酶。我们认为单宁酶水解没食子酸酯，生成没食子酸，导致了发酵中上述化合物含量变化。另外，绿原酸酯酶可能水解咖啡酸酯、香豆酸酯和肉桂酸酯（Fig 6B）。儿茶酚（Catechol）是一个带羟基的苯环，可以看作酚类物质的结构单元。我们发现了19个可能参与儿茶酚氧化、异构和降解的酶，构建了一个儿茶酚代谢的网络（Fig 6C）。如：儿茶酚O-甲基转移酶催化儿茶酚形成甲氧基酚，苯酚 2-单加氧酶氧化苯酚形成儿茶酚，儿茶酚双加氧酶降解儿茶酚进入三羧酸循环。(1) 糖苷水解酶水解酚糖苷，或糖基转移酶合成新的糖苷；(3)酚类物质被儿茶酚O-甲基转移酶、苯酚2-单加氧酶、水杨醛脱氢酶、水杨酸1-单加氧酶、儿茶酚2,3-双加氧酶、儿茶酚1,2-双加氧酶和槲皮素2,3-双加氧酶氧化、转化或降解。据我们所知，这是第一次详细报道普洱茶发酵过程参与酚类物质代谢的酶。
图6 酚物质代谢相关酶。(A) 发酵过程中单宁酶的化学反应和没食子酸水平的变化。(B)单宁酶，绿原酸水解酶，以及没食子酸、咖啡酸、肉桂酸、奎宁酸和没食子酸水平的变化。(C) 邻苯二酚氧化和降解的酶网络。(D) 槲皮素2,3-双加氧酶的化学反应，槲皮素及相关化合物含量的变化。
从我们整合应用了meta-barcoding、宏蛋白组和代谢组学技术系统分析了2次普洱茶发酵的微生物组。通过研究发现了普洱茶发酵过程菌群的演替与联系，代谢物的变化。我们发现微生物产生碳水化合物活性酶降解茶和真菌多糖，以供微生物生长繁殖。另外也发现了参与水解、氧化、修饰和降解酚类物质的酶(Fig 7）。本研究丰富了菌群与代谢物演替，以及微生物功能等方面的普洱茶发酵机理。 
图7 参与多糖降解和酚类化合物代谢的微生物酶概览
1. Wolfe, B. E., and R. J.Dutton. 2015. Fermented Foods as Experimentally Tractable Microbial Ecosystems.Cell 161:49-55.2. Wolfe, B. E., J. E.Button, M. Santarelli, and R. J. Dutton. 2014. Cheese rind communities providetractable systems for in situ and in vitro studies of microbial diversity. Cell158:422-33.3. Li, Z., C. Feng, X.Luo, H. Yao, D. Zhang, and T. Zhang. 2018. Revealing the influence of microbiotaon the quality of Pu-erh tea during fermentation process by shotgun metagenomicand metabolomic analysis. Food Microbiol 76:405-415.4. Zhao, M., D. L. Zhang,X. Q. Su, S. M. Duan, J. Q. Wan, W. X. Yuan, B. Y. Liu, Y. Ma, and Y. H. Pan.2015. An Integrated Metagenomics/Metaproteomics Investigation of the MicrobialCommunities and Enzymes in Solid-state Fermentation of Pu-erh tea. Sci Rep5:10117.
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