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文章信息 题目：CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of VvbZIP36 promotes anthocyanin accumulation in grapevine (Vitis vinifera) 刊名：Horticulture Research 作者：Mingxing Tu, Yulin Fang et al. 单位：Northwest A&F University Published date: 20 February 2022 摘要 1 花青素是植物次生代谢产物，具有多种生物学功能。花青素的积累受转录激活因子和抑制因子的调节。研究表明，bZIP 家族成员主要作为花青素生物合成的正调节剂，但负调节的报道很少。在这里，我们报告了来自葡萄 ( Vitis vinifera ) bZIP 基因 VvbZIP36作为花青素生物合成的负调节剂。用 CRISPR/Cas9敲除葡萄中VvbZIP36的一个等位基因促进了花青素的积累。转录组和代谢组数据的相关性分析表明，一系列花青素生物合成基因在VvbZIP36中被激活相对于野生型的突变植物，导致相关代谢物的积累，包括柚皮素查尔酮、柚皮素、二氢黄酮醇和花青素-3- O-葡萄糖苷。芪类（α-viniferin）、木脂素和一些黄酮醇（包括槲皮素-3- O-鼠李糖苷、山柰酚-3- O-鼠李糖苷和山柰酚-7- O-鼠李糖苷）的合成受到显着抑制，并且一些相关的新陈代谢在突变植物中被下调。总之，我们的结果表明，VvbZIP36是花青素生物合成的负调节剂，在平衡二苯乙烯（α-葡萄素）、木脂素、黄酮醇和花青素的合成中发挥作用。 技术路线 2
主要结果 3 3.1 VvbZIP36的生物信息学分析 在之前的研究中，从葡萄藤 ( V. vinifera )中鉴定出 47 个 bZIP TF 编码基因。组织特异性表达分析表明，bZIP基因VvbZIP36在叶、茎、花、卷须，尤其是果实中高表达。在本研究中，发现VvbZIP36在葡萄的根、卷须、茎、叶和果实中表达，在成熟茎、座果叶、衰老叶和成熟果实中表达量最高（图 1A），类似于以前的研究。根据使用拟南芥和水稻的 bZIP TF 序列的系统发育分析，我们发现VvbZIP36在 K 亚组中被归类为AtbZIP60和OsbZIP74的同源物，它们编码具有 bZIP 结构域和跨膜结构域 (TMD) 的蛋白质。先前的研究表明，AtbZIP60和OsbZIP74分别在拟南芥和水稻的内质网 (ER) 应激反应中发挥重要作用。为了进一步分析 K 组 bZIP TF，搜索了NCBI中 VvbZIP36 同源物数据库，发现了来自其他物种的 25 个序列，所有这些序列都包含 bZIP 结构域。在分析它们的系统发育关系时，如图1B所示，发现VvbZIP36与Camellia sinensis bZIP18和Ipomoea nil bZIP60的亲缘关系最密切。
3.2 敲除VvbZIP36等位基因促进葡萄花青素积累 在我们之前的研究中，利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统成功敲除葡萄中VvbZIP36的一个等位基因，获得了一株突变的葡萄植物（KO45）。通过全基因组测序 (WGS)确定，在 KO45 中未发现脱靶事件。随后，通过对再生株系的不断鉴定，从22株再生植株中鉴定出7株转基因阳性植株。其中，通过Sanger测序发现突变株系KO21。如图2A所示，我们为VvbZIP36的第一个外显子设计了四个 CRISPR/Cas9 sgRNA，但在 KO21 和 KO45 中只有靶标 1 发生了突变。此外，发现 KO21 和 KO45 系含有单等位基因突变，在 KO21 中有碱基插入，在 KO45 中有碱基缺失。 观察到KO21和KO45的叶子变红（图2B），推测VvbZIP36在调控花青素生物合成中起作用。因此，我们从突变株系（KO21 和 KO45）和野生型（WT）中收集叶子来确定总花青素含量。如图2C、D 所示， KO21 和 KO45 叶片中的花青素水平均显着高于 WT。
3.3 花青素生物合成基因在 KO45 和 WT 植物之间差异表达 为了进一步分析VvbZIP36和花青素生物合成之间的联系，我们对正常条件下生长的植物的 KO45（无脱靶事件）和 WT 叶片进行了 RNA-seq 分析。在 KO45 和 WT 之间共鉴定出 4103 个 DEG，包括 1965 个上调基因和 2138 个下调基因。如图3A所示，GO分析显示，大部分下调的DEG与“光合作用”、“四吡咯”和“细胞壁”有关。相比之下，参与“脂质合成”、“脂肪酸合成”、“氨基酸代谢”和“活性氧”的 DEGs 则上调和下调。最后，大多数与酚类化合物代谢相关的DEGs被上调。 随后，对4103个DEGs进行了KEGG通路富集分析，发现“转录因子”与“错配修复”、“次级代谢物生物合成”、“DNA复制”、“苯丙氨酸代谢”、“类黄酮生物合成”和“苯丙烷“生物合成”途径在 1965 个上调基因中显着富集（图 3B）。相比之下，“光合作用”、“脂肪酸延伸”、“脂质”、“维生素和能量代谢”、“转运蛋白”和“信号转导”途径在 2138 个下调基因中显着富集（图 3C）。通过进一步分析，发现大部分与酚类化合物相关的基因都与黄酮类生物合成途径相关。我们鉴定了 28 个基因（包括查耳酮合酶CHS；查尔酮异构酶CHI；黄烷酮 3-羟化酶F3H；类黄酮 3'-羟化酶 F3'H；二氢黄酮醇 4-还原酶DFR；黄酮醇合酶FLS；和花青素合酶ANS ) 基于 KEGG 和 MapMan 富集分析结果 (表 1 ) 与黄酮类生物合成有关。
3.4 代谢组分析表明VvbZIP36调节葡萄藤中花青素的生物合成 为了进一步研究VvbZIP36的功能，比较了转基因 (KO45) 和 WT 植物叶片的代谢组。共鉴定和量化了 KO45 和 WT 之间的 347 种差异显著的代谢物；KO45 中 185 个比 WT 上调，162 个下调。在 KO45 中含量最高的前 20 种代谢物中，以黄酮类、三萜类、黄烷醇类、花青素类、有机酸类和二苯乙烯类为主，而减少幅度最大的 20 种代谢物主要是黄酮醇类、木脂素类、有机酸类、氨基酸及其衍生物，以及酚酸。 对差异显著的代谢物的 KEGG 富集分析揭示了主要围绕氨基酸及其衍生物、有机酸、木脂素、脂质、芪、萜类化合物、单宁、类黄酮和酚酸途径。与脂质、有机酸、木脂素和氨基酸及其衍生物相关的代谢物在 KO45 叶片中的含量降低，而与萜类、芪、单宁和类黄酮途径相关的代谢物水平升高（图4、5）。
3.5 VvbZIP36在花青素生物合成调控中很重要 为了进一步了解参与调节花青素生物合成的VvbZIP36相关调控网络，对转录组和代谢组数据进行了相关性分析。花青素生物合成途径中的基因（5 个PAL、3 个CHS、2个CHI、2个F3′H、2个F3H、1 个DFR和 1 个ANS基因）在 KO45 中的表达普遍高于 WT，相应的代谢物，如作为柚皮素查尔酮，柚皮素、二氢黄酮醇和花青素含量不同程度地上调（图6）。有趣的是，所有差异丰富的木脂素代谢物在 KO45 中均低于 WT，而来自早期一般苯丙素途径的五个PAL基因在 KO45 中以更高水平表达（图 6）。
随后，从图 6中随机选择了 30 个参与苯丙素途径的 15个，用于 qRT-PCR 验证表达分析。如图7所示，除VvF3H2和VvLAR1外，它们的表达模式与转录组数据一致。
总结 4 总之，本实验的结果表明，VvbZIP36通过平衡葡萄中二苯乙烯（α-葡萄素）、木脂素、黄酮醇和花青素的合成，有助于调节花青素的生物合成。这项研究为花青素生物合成的调控提供了新的见解，这将对葡萄育种提供了重要参考。 获取原文 5 原文链接：https://academic./hr/article/doi/10.1093/hr/uhac022/6532215?searchresult=1 |
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