生物技术前沿一周纵览（2017年1月20日）

生物技术前沿一周纵览（2017年1月20日）

小麦DNA-free基因组编辑方法取得进展

CRISPR/Cas9是目前应用最为广泛的基因组编辑技术，已在作物基因功能研究以及品种改良中取得了巨大的成功。常规植物基因组编辑手段多通过农杆菌或基因枪的方法将CRISPR/Cas9 DNA表达框转入并整合到植物基因组中，存在许多不足，如较高的潜在脱靶效应、易出现嵌合体、需通过后代分离方可获得无CRISPR/Cas9 DNA植物突变体。研究人员将CRISPR/Cas9蛋白和gRNA在体外组装成核糖核蛋白复合体（RNP），再利用基因枪法将CRISPR/Cas9 RNP转入小麦细胞中，在两个六倍体小麦品种中分别对两个不同基因tagw2和tagasr7进行了定点编辑，成功地在小麦中建立了全程无外源DNA的基因组编辑体系。研究结果还表明相比于CRISPR/Cas9 的DNA或RNA瞬时表达体系，CRISPR/Cas9 的RNP可以明显降低脱靶效应。这种DNA-free的基因组编辑方法具有精准、特异、简单易行、成本低廉的优势，并且成功避免了外源DNA片段整合到基因组中的潜在风险。这一利用CRISPR/Cas9 RNP实现小麦基因组编辑的方法有助于最大程度地减少监管，建立起精准、生物安全的新一代育种技术体系，加快作物基因组编辑育种产业化进程。（Nature）


过表达RAG2提高水稻粮食产量和品质

提高粮食产量、改善粮食品质是水稻育种的主要目标。因此，确定影响水稻粮食产量和营养品质的因素是开发新育种策略的基础。RAG2是水稻14~16 kDa的α-淀粉酶/胰蛋白酶的抑制剂，属于种子贮藏蛋白中的白蛋白。华中农业大学的研究团队研究了RGA2对水稻产量的影响。该研究小组发现RAG2在成熟种子中特异性表示，它的转录峰值出现在开花后14至21天之间。过表达RAG2的株系与野生型相比，籽粒大小和千粒重显著增加。相反，在RAG2的表达受到抑制的株系中籽粒减小。在过表达RAG2和RAG2表达受抑制的株系中，蛋白质含量和总脂质也分别增加和减少。过表达RAG2使籽粒大小显著增加，提高了粮食品质和产量。这些结果表明，RAG2在控制水稻粒重和种子质量中起着重要作用。（Plant Biotechnology Journal）


水稻OsACOS12基因对花粉外壁形成和花药发育至关重要

拟南芥的ACOS5基因参与花粉外壁的主要成分孢粉素前体的生物合成。来着上海师范大学的研究团队在水稻中发现了它的直系同源基因OsACOS12，并与拟南芥中的基因进行了比较。分析表明，OsACOS12中63.9%的氨基酸序列与ACOS5相同。LOC_Os04g24530终止密码子提前出现引起OsACOS12隐性突变在水稻中表现出雄性不育表型。进一步分析表明，OsACOS12在绒毡层细胞和小孢子中表达，它编码的蛋白在绒毡层细胞和药室中积累。当用ACOS5的启动子启动OsACOS12时，可以部分恢复拟南芥ACOS5隐性突变体的雄性不育。本研究发现OsACOS12是ACOS5的水稻直系同源基因，对水稻中孢粉素的合成至关重要。ACOS5和OsACOS12与单子叶植物和双子叶植物物种中花粉壁的形成有关。（BMC Plant Biology）


发现植物关闭遮光机制提高生产力

一个国际研究小组通过改变光合作用机制成功地提高了植物生产力，该研究以烟草植物中参与遮光的3个基因为靶标基因，这些基因可将光子转换为无害的能量，从而保护植物免受强光的伤害。然而，植物对不断变化的光强度反应缓慢，会导致生产力下降。为了提高光合作用效率，研究人员增强了这3个基因的表达，在田间条件下使改造的烟草植物生产力提高了14%-20%。这是一个巨大的飞跃，因为植物育种者通过传统技术很难实现1%-2%的增长。目前，科学家们正在改变水稻、玉米等作物的光合作用效率。（Science）


发现病原菌攻击宿主的新致病机制

疫霉菌引起的作物疫病曾被称为“植物瘟疫”，是农作物生产中危害非常严重的一类病害，目前已经发现的疫病菌有160多种，能侵染数千种植物，是全球粮食、食品和生态安全的重要威胁。在我国，由疫霉菌引起的农作物病害每年导致的经济损失高达上百亿元。但是由于这类病害具有发病快、变异快、流行快等特点，生产上的防控一直比较困难。最新研究中，研究人员从全新的视角报道了病原菌攻击宿主的新致病机制：诱饵模式，为实现作物疫病的可持续控制指明了新的方向。研究人员发现疫霉菌在侵染植物早期向胞外分泌糖基水解酶XEG1攻击植物细胞壁，而植物则利用水解酶抑制子GIP1抑制其活性；在进化的过程中，病原菌又获得了XEG1的失活突变体XLP1，以诱饵“DECOY”的方式，竞争性干扰抑制子GIP1，与XEG1协同攻击植物的抗病性。由于糖基水解酶XEG1在卵菌、真菌和细菌中广泛存在，因此这一发现为开发能诱导植物广谱抗病性的生物农药提供了重要的理论基础。（Science）


新型CRISPR-Cas系统C2c2-RNA复合物结构

CRISPR/Cas系统是古菌和细菌的抵抗病毒和质粒侵染的重要免疫防御系统。2015年发现第二类CRISPR-Cas系统-Ⅵ型系统，该系统中的效应蛋白被命名为C2c2。研究人员通过深入的研究，解析了C2c2与crRNA的二元复合物的晶体结构以及C2c2蛋白的晶体结构，揭示了C2c2包含一个crRNA识别的叶片即REC叶片，和一个核酸酶叶片即NUC叶片。REC叶片包含NTD结构域（N-terminal domain）和Helical-1结构域，NUC叶片包含了两个HEPN结构域、Helical-2结构域以及连接两个HEPN结构域的连接结构域。负责切割前体crRNA和靶标 RNA的活性口袋分别位于Helical-1和HEPN结构域上。crRNA的结合会引起C2c2蛋白的构象变化，这种变化很可能会稳定crRNA的结合，进而对识别靶标RNA起着重要作用。该研究通过结构和生化研究揭示了C2c2剪切pre-crRNA以及切割靶标 RNA的分子机制，对认识细菌抵抗RNA病毒入侵的分子基础具有十分重要的意义。同时也为改造CRISPR-C2c2系统，为其在基因编辑领域的运用提供了强有力的结构基础，有助于加速对病毒感染引发的疾病的理解、治疗和预防。（Cell）


CRISPR/ Cas9技术改变拟南芥的病毒抗性

真核翻译起始因子eIF基因家族，包括eIF4E及其旁系同源基因eIF(iso)4E，已经被确认为马铃薯Y病毒属病毒隐性抗性等位基因。然而，人们对于这些等位基因的认识是有限的。英国爱丁堡大学的Douglas E. Pyott利用CRISPR / Cas9技术在拟南芥eIF(iso)4E基因座引入了序列特异性有害点突变，来改变对芜菁花叶病毒(TuMV)的抗性。通过分离CRISPR/Cas9转基因诱发的突变，该研究团队设计了一个框架，用于使自花授粉物种生成可遗传的、纯合子突变而不含转基因的T2代植株。对4个独立的T3株系干重和开花时间分析显示，与野生型植物相比并没有差异，表明eIF(iso)4E的突变不会影响植物的生长。这项研究表明，CRISPR/Cas9技术是一种不使用转基因而可以在一些重要作物中生成马铃薯Y病毒属病毒抗性等位基因的新方法。（Molecular Plant Pathology）


放线菌天然产物合成取得新进展

由始旋链霉菌（Streptomyces pristinaespiralis）产生的普那霉素(Pristinamycin)是一种抗耐药菌抗生素，包含普纳霉素I（PI）和 II（PII）两个组分，其衍生物已被批准用于治疗多种临床耐药性病原菌，如耐甲氧西林葡萄球菌与耐万古霉素肠球菌等。研究人员通过组合代谢工程与发酵工艺优化，初步提高了普那霉素II（PII）的合成能力。进一步创新技术研究中，建立了基于“一个整合酶-多个attB位点”理念的放线菌天然产物生物合成基因簇多拷贝整合的新方法MSGE。运用该方法，实现了PII生物合成基因簇的高效、快速扩增，获得了多达5个PII生物合成基因簇拷贝的工程菌SBJ1005。该工程菌的最高产量达到2.2 g/L，与出发菌株相比，提高了11倍，已基本接近产业化要求。在此过程中，还组合运用体外CRISPR/Cas9系统与Gibson等温一步法，开发了一种新型的基因簇编辑技术CGE，为放线菌天然产物生物合成体系的优化提供了重要的技术手段。（Metabolic Engineering）